♦ Thí nghiệm 7.1: Tách ADN từ lá cây đậu tương chuyển gen T0
Sử dụng ADN đã được tách chiết từ lá, đem điện di trên gel agarose 0,8% thu được băng điện di như hình 16.
Hình 16. Điện di ADN tổng số tách từ lá cây thí nghiệm
Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm tách có độ tinh sạch khá cao, không bị đứt gãy nhiều, đủ tin cậy để thực hiện các thí nghiệm về sau.
♦ Thí nghiệm 7.2: Thử hygromycin với mẫu lá cây chuyển gen T0 và PCR mẫu ADN đã tách từ thí nghiệm 7.1
1 2 3
4 5 6
7 8 9
Hình 17. Ảnh hưởng của hygromycin khi thử nghiệmvới mẫu lá cây thí nghiệm và cây đối chứng
Tiến hành thí nghiệm thử hygromycin với mẫu lá cây đậu tương đã qua quy trình chuyển gen và chuyển ra đất thành công, đem khử trùng bằng ethnol 70% và NaClO 15%, rửa với nước cất khử trùng 4-5 lần. Sau đó, đem cấy mẫu trong MS có bổ sung hygromycin 50mg/l trong 7 ngày. Sau 7 ngày, chúng tôi đã quan sát thấy sự biểu hiện của mẫu cây thí nghiệm và cây đối chứng ở hình 17.
Quan sát hình 17 thấy rằng: Ở mẫu lá cây thí nghiệm sau 7 ngày cấy trên môi trường MS có hygromycin 50 mg/l, chúng tôi quan sát thấy mẫu vẫn có màu xanh, còn mẫu đối chứng có hiện tượng chuyển sang màu vàng. Điều này chứng tỏ rằng trong mẫu lá cây thí nghiệm có thể đã có chứa gen kháng hygromycin.
M 1 2 3
Hình 18. Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen gus
Ghi chú: M: marker 1: mẫu đối chứng (+) 2-3: mẫu ADN từ lá 2 cây T0
Kết quả phân tích với cặp mồi gus cho thấy, mẫu ADN tổng số từ lá 2 cây chuyển gen T0 không biểu hiện dương tính với cặp mồi đặc hiệu cho gen gus. Điều này có thể do điều kiện thực hiện thí nghiệm hoặc số lượng mẫu chưa đủ lớn, nhưng vì điều kiện thời gian không cho phép, chúng tôi dừng lại ở kết quả này.
Như vậy, trong khóa luận này, chúng tôi đã sử dụng gen gus làm chỉ thị sàng lọc và để thống kê số mẫu có biểu hiện dương tính với gus, từ đó tính được tần số chuyển gen vào giống ĐT26. Chúng tôi đã thực hiện 4 thí nghiệm có liên quan đến việc thử nghiệm gus, và đã thu được tần số chuyển gen dao động từ 12-20,5%, tuy rằng khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ với sự biểu hiện tạm thời của gen gus [1]. Nhưng kết quả này đã tạo ra được thành công nhất định trong quá trình thử nghiệm chuyển gen vào đậu tương nói chung và các giống đậu
gen đích và chuyển vào đậu tương thông qua A.tumefaciens sử dụng phương pháp gây tổn thương nốt lá mầm của hạt, hứa hẹn những thành tựu mới trong tương lai.
Chương IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận
Dựa trên kết quả thu được từ thí nghiệm, chúng tôi rút ra những kết luận sau:
1. Sử dụng NaClO 15% với thời gian 13,5 phút để khử trùng mẫu, tạo vật liệu khởi đầu cho quá trình chuyển gen vào đậu tương. Trước khi khử trùng bằng NaClO rửa mẫu với ethanol 70% trong 3 phút để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập cho NaClO. Phương pháp này cho hiệu quả khử trùng cao, không độc cho mẫu với tỷ lệ mẫu sống là 87,5%.
2. Đã xây dựng được quy trình chuyển gen vào đậu tương giống ĐT26 sau chuyển gen gus có sử dụng phương pháp gây tổn thương nốt lá mầm và trụ dưới lá mầm của hạt với chủng khuẩn sử dụng là AGL1 có OD=0,6-1,0. Thời gian lây nhiễm là 60 phút. Đã thu được tần số biểu hiện gen gus tạm thời khá cao từ 12-20,3%. 3. Thí nghiệm phân tích cây chuyển gen cho thấy sự có mặt của gen hpt II trong lá
của cây chuyển gen T0 qua kết quả thử hygromycin với lá cây chuyển gen T0. Thí nghiệm PCR ADN tổng số từ lá với mồi gus có biểu hiện âm tính, điều này ngược lại với khẳng định trên.
Đề nghị
1. Tiếp tục cải thiện biểu hiện gus trong dòng đậu tương ĐT26 bằng cách bổ sung các chất làm tăng hiệu quả chuyển gen như L-cystein, DTT, Natri thiosunfat.
2. Làm lại thí nghiệm PCR với ADN tổng số từ lá cây chuyển gen T0, để khẳng định lại sự có mặt có gen gus.
3. Hoàn thiện quy trình chuyển gen đích vào dòng ĐT26 như gen kháng hạn, kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ,…
4. Thử nghiệm quy trình này với các giống đậu tương Việt Nam và các giống nước ngoài khác.
5. Nghiên cứu tạo ra cây đậu tương chuyển gen và sử dụng làm giống trồng trên diện tích rộng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen (động vật, thực vật), NXB ĐH Huế, Huế.
2. Trần Văn Điền (2007), Giáo trình cây Đậu tương, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. 3. Nguyễn Thúy Điệp, Kiều Thị Dung, Đặng Minh Trang, Lê Việt Chung, Đặng
Trọng Lương, Trương Thị Thanh Mai (2005), “Kết quả nghiên cứu ban đầu về khả năng tái sinh của một số giống đậu tương phục vụ kỹ thuật chuyển gen”,
Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 20, tr. 35-38.
4. Nguyễn Thị Hiền và Vũ Thy Thư (2004), Hóa Sinh học, NXB Đại học Sư phạm, Hà Nội.
5. Trần Thị Cúc Hòa (2007), “Nghiên cứu khả năng đáp ứng chuyển gen của các giống đậu tương trồng ở Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 18, tr. 9-14.
6. Trần Thị Cúc Hòa (2008), “Hiệu quả tạo dòng đậu tương biến đổi gen từ giống MTĐ 176, KL202, Maverick và William 82 bằng phương pháp nốt lá mầm qua trung gian Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 1, tr. 14-19.
7. Trần Thị Cúc Hòa (2008), “Tối ưu hóa quá trình chuyển gen đậu tương bằng cải tiến phương pháp lây nhiễm với Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 9, tr. 8-11.
8. Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Xuân Tài, Đinh Thị Phòng, Chu Hoàng Hà (2005), “Chuyển gen gus vào cây bông thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Hội Nghị Khoa học Toàn Quốc 2005 Công nghệ Sinh học trong nghiên cứu cơ bản, Hà Nội 12/2005, tr. 293-296.
9. Đinh Thị Phòng, Nguyễn Thị Thu (2007), “Chuyển gen gus vào đỉnh phôi hạt chín giống đậu tương ĐT12 thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 4, tr. 471-478.
10. Phạm Gia Thiều (2006), Kỹ thuật trồng và chế biến sản phẩm cây đậu tương, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
11. Tổng cục thống kê (2010), Niên giám thống kê 2009, NXB Thống kê, Hà Nội. 12. Trung tâm thông tin PTNNNT-Viện chính sách và chiến lược PTNNNT-Bộ Nông
nghiệp & PTNT (2010), Bản tin tháng 3/2010 ngành hàng lương thực, Bộ NN&PPNT, Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
13. Bayer CropScience (2009), “Bayer CropScience expands Global R&D activities in seeds and traits by setting up new research focus area in cereals”, Bayer Crop Science July 21, 2009.
14. Carlson R. (2009), “The Market Value of GM Products”, Nature Biotechnology, 27, p. 984.
15. Cheng M., Lowe B.A., Spencer T.M., Ye X.D. and Armstrong C.L., (2004), "Factors influencing Agrobacterium-mediated transformation of monocotyledonous species", In Vitro Cellular and Developmental. Biology- Plant, 40(1), pp. 31-45.
16. Doyle J.J. and Doyle J.L. (1987), “A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissues”, Phytochemical Bulletin,19, pp. 11-15.
17. FAOSTAT (2009), Agricultural data, available from: http://faostat.fao.org./
18. Frame B.R., McMurray J.M., Fonger T.M., Main M.L., Taylor K.W., Torney F.J., Paz M.M., Wang K. (2006), “Improved Agrobacterium mediated transformation of maize embryos using a standard binary vector system”, Plant Cell Rep, 129, pp. 13-22.
19. Hymowitz T. and Newell C.A. (1981), “Taxonomy of the genus Glycine
domestication and uses of soybeans”, Economic Botany, 35, pp.272-288.
20. ISAAA (2009) ISAAA Celebrates the Life of its Founding Patron, Nobel Peace Laureate Dr. Norman E. Borlaug (1914-2009), ISAAA Brochure available at: http://www.isaaa.org/kc/cropbiotechupdate/tribute/borlaug/ISAAA-Tribute.pdf 21. Karami O. (2008), “Factors affecting Agrobacterium mediated transformation of
22. Karami O., Ashari E.M., Karami K.G. and Aghavaisi B. (2009), “Agrobacterium- mediated genetic transformation of plants: the role of host”, Biologia Plantarum, 53(2), pp. 201-212.
23. Li D., Chen P., Alloatti J., Shi A. and Chen Y. F. (2010), “Identification of New Alleles for Resistance to Soybean Mosaic Virus in Soybean”, Published in Crop Science, 50, pp. 649-655.
24. Liu J.Y., Cheng Y.Q. and Li J.A. (2009), “Optimization of soybean (Glycine max (L.) Merrill) in planta ovary transformation using a linear minimal gus gene cassette”, Plant Cell, 10(12), pp. 870-876.
25. Liu S.J., Wei Z.M., Huang J.Q. (2008), “The effect of co-cultivation and selection parameters on Agrobacterium-mediated transformation of Chinese soybean varieties”, Plant Cell Rep, 28, pp. 489-498.
26. Paz M.M., Huixia S., Zibiao G., Zhanyuan Z., Anjan K. B. & Wang K. (2004), “Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant”, Euphytica, 136, pp. 167- 169.
27. Paz M.M., Martinez J.C., Andrea B.K., Fonger T.M, Wang K. (2006), “ Improved colyledonary node method using an alterative explant derived from mature seed for effcient Agrobacterium-mediated soybean transformation ”, Plant Cell Rep, 25, pp. 206-213.
28. Alimohammadi M. and Bagherieh M.B. (2009), “Agrobactrium-mediated transformation of plants: Basic principles and influencing factors”, African Journal of Biotechnology Vol. 8 (20), pp. 5142-5148.
29. Olhoft P.M & Somers D.A. (2001), "L-Cysteine increases Agrobacterium- mediated T-DNA delivery into soybean cotylendonary-node cells”, Plant Cell Rep, 20, pp.706-711.
30. Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M., Somers D.A, (2003), "Efficient soybean transformation using hygromycine B selection in the cotylendonary-node method", Planta, 216, pp. 723-735.
31. Xue R. G., Xie H.F., Zhang B. (2006), “A multi-needle-assisted transformation of soybean cotyledonary node cells”, Biotechnol Lett, 28, pp. 1551-1557.
32. Stachel S.E., Nester E.W., and Zambryski P. (1986), “A plant cell factor induces
Agrobacterium tumefaciens vir gene expression”, Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 83, pp: 379 – 383.
33. Sunikumar G., Rathore K.S., (2001), “Transgenic cotton: factors influencing
Agrobacterium-mediated transformation and regeneration", Molecular Breed, 8, pp. 37-52.
34. Suryadevara S.R., Lewamy M., Matt M., Raghuveer P., Prachuab K. and David H. (2009), “Non-antibiotic selection systems for soybean somatic embryos: the lysine analog aminoethyl-cystein as a selection agent”, BMC Biotechnology, 94, pp.1472-1489.
35. Tran Thi Cuc Hoa, Tran Vu Hai and La Cao Thang (2008), “Transformation efficiencies of the Soybean Variety PC 19 [Glycine max (L.) Merrill] using
Agrobacterium tumefaciens and the cotyledonary node method”, Omorice, 16, pp. 1-8.
36. USDA National Agriculture Statistics Service (NASS) 2009a. Adoption of Genetically Engineered Crops in the. 2009. National Agriculture Statistics. http://www.ers.usda.gov/Data/BiotechCrops/.
37. Wang M.B., Waterhouse P. M. (1997), “A rapid and simple method of assaying plants transformation with Hygromycin or PPT resistance”, Plant Molecular Biology Reporter, 15, pp. 209-215.
38. Wei D. and Zhi-ming W. (2007), “An optimized Agrobacterium-mediated transformation for soybean for expression of binary insect resistance genes”,
Plant Science, 173(4), pp. 381-389.
39. Zeng P., Vadnais D.A., Zhang Z., Polacco J.C. (2004), “Refined glufosinate selection in Agrobacterim-mediated transformation of soybean (Glycine max (L.) Merrill)”, Plant Cell Rep, 22, pp. 478-482.
40. Zhang W., Subbarao S., Addae P., Shen A., Armstrong C.L., Peschke V., Gilbertson L., (2003), "Cre/lox mediated marker gene excision in transgenic maize (Zea mays L.) plants", TAG Theoretical and Applied Genetics, 107, pp. 1157-1168.
PHỤ LỤC 1. Môi trường MS (PH=5,6-5,8) Bảng 12. môi trường MS (PH=5,6-5,8) STT Thành phần (g/l) Lượng lấy (ml) 1 KNO3 1900 20 2 NH4NO3 1650 20 3 KH2PO4 170 10 4 MgSO4.7H2O 370 10 5 CaCl2.2H2O 440 10 6 FeSO4.7H2O Na2EDTA 27,8 37,3 10 7 (B5 Minor) H3BO3 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O KI Na2MoO4.2H2O CuSO4 CoCl2.6H2O 0,3 0,76 0,2 0,075 0,025 0,0025 0,0025 10 8 (B5 Vitamins) Myo-inositol Nicotinic acid Pyridoxin-HCl Thiamin-HCl 10 0,1 0,1 1 20 2. Môi trường LB (PH = 7) Bảng 13. Môi trường LB (PH = 7) Thành phần g/l Pepton (trypton) 10 Yeast extract 5 NaCl 10
3. Môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu
Bảng 14. Môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu
Môi trường Thành phần Tác dụng Ghi chú
C1 PH= 5,4-5,6 ½ MS salts; B5 vitamins; BAP 1mg/l; L-cystein 1g/l (*); Sucrose 30g/l ; AS 0,1mM (*) Sử dụng để rửa mẫu trước khi chuyển gen và
dùng để nuôi vi khuẩn A.tumefaciens C2 PH= 5,6-5,8 ½ MS salts; B5 vitamins; BAP 1mg/l; L-cystein 1g/l (*); Sucrose 30g/l ; AS 0,1mM (*); Agar 13g/l Dùng để đồng nuôi cấy mẫu chuyển gen với vi
khuẩn A.tumefaciens Nuôi 5 ngày trong tối chuyển sang C3 C3 PH= 5,6-5,8 ½ MS salts; B5 vitamins; BAP 1mg/l; Sucrose 30g/l; Kanamycin 200mg/l (*); Agar 13g/l.
Dùng để tái sinh mẫu chuyển gen sau khi đồng
nuôi cấy Nảy mầm 8 ngày ở 260C, 18h/6 sáng tối. chuyển sang C4 C4 PH= 5,8 ½ MS salts; B5 vitamins; BAP 1,5 mg/l; Sucrose 30g/l; Kanamycin 200mg/l (*); Agar 13g/l. Dùng để nhân chồi từ
mẫu chuyển gen chuyển sang Nuôi 21 ngày C5 C5 PH= 5,8 ½ MS salts; B5 vitamins; BAP 1,5 mg/l; Sucrose 30g/l; GA 0,5mg/l; IBA 0,1mg/l; Kanamycin 200mg/l (*); Hygromycin 200mg/l (*); Agar 13g/l.
Kéo dài chồi và chọn lọc thực vật
Nuôi đến khi nào chồi dài 3-5cm thì chuyển sang C6 C6 PH=5,8 ½ MS salts; B5 vitamins; Sucrose 30g/l; IBA 1,5mg/l; BAP 0,5mg/l; Agar 13g/l.
Kích thích mẫu ra rễ Đến khi mẫu ra rễ khỏe mạnh thì
chuyển ra đất