Các ph-ơng pháp xác định thành phần hóa học của ti- 123docz.net

3. Đối t-ợng nghiên cứu

2.6. Các ph-ơng pháp xác định thành phần hóa học của tinh dầu

2.6.1. Ph-ơng pháp sắc ký - khí

Ph-ơng pháp sắc ký - khí là một ph-ơng pháp hiện đại, có hiệu lực cao đã ứng dụng vào hầu hết các lĩnh vực nghiên cứu khoa học cũng nh- đời sông sản xuất. Trong hóa học hữu cơ có khoảng 80% các hợp chất đ-ợc phân tích bằng sắc ký - khí.

2.6.1.1. Bản chất của ph-ơng pháp sắc ký - khí

Sắc ký khí là một trong quá trình dựa trên cơ sở của sự chuyển dịch một lớp dán đoạn chất dọc lớp chất hấp phụ trong một pha động và liên hệ với sự lặp lại nhiều lần các giai đoạn hấp phụ. Quá trình sắc ký xảy ra khi có sự phân bố hợp chất giữa hai pha trong đó một pha chuyển dịch so với pha kia.

Nguyên lý cơ bản của sự tách bằng sắc ký khí là sự phân bố chất thử thành hai pha. Một pha gọi là pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc rỗng, pha kia gọi là pha động là chất khí di chuyển qua pha tĩnh.

Chất thử có thể là chất khí, lỏng hoặc rắn, đ-ợc chuyển thành thể hơi nhờ một lồng khí trơ làm chất mang qua pha tĩnh. Nếu pha tĩnh là một chất rắn gọi là sắc ký khí rắn. Nếu pha tĩnh là một chất lỏng thì gọi là sắc ký khí - lỏng.

Khi đ-a vào cột một hỗn hợp chất nào đó muốn đạt đ-ợc mức độ tách hoàn toàn, tr-ớc hết bề mặt tiếp xúc giữa hai pha phải lớn, bề dày lớp tiếp xúc giữa hai pha phải đủ nhỏ (vì quá trình khuyếch tán chất sẽ làm giảm hiệu quả tách). Và sau cùng là sự chuyển dịch có h-ớng của một pha (pha động) so với pha kia (pha tĩnh). Nh- thế nào đó để mỗi cấu tử trong hỗn hợp đ-ợc phân bố giữa hai pha phù hợp với tính chất hấp phụ hoặc hoà tan của nó.

Vì pha động chuyển dịch liên tục nên ngoài nhiệm vụ đ-a các chất lên bề mặt pha tĩnh nó còn có nhiệm vụ tiếp nhận các phần tử chất phân tích đã hấp phụ tr-ớc đó bị giải hấp phụ tới t-ơng tác với phần khác của bề mặt pha tĩnh, nói cách khác đó là quá trình chuyển từ đĩa lý thuyết này tới đĩa lý thuyết khác mà ở đó tồn tại cân bằng động của sự hấp phụ và giải hấp phụ.

Quá trình chuyển chất lên đĩa diễn ra liên tục giữa pha tĩnh và pha động chuyển dịch từ đầu cột đến cuối cột dẫn tới sự phân vùng riêng biệt các chất trong cột sắc ký.

Ghi lại từng phần này khi đi ra khỏi cột sẽ biết đ-ợc sắc đồ tách chất của cột sắc ký.

Quá trình tách chất trên cột sắc ký đ-ợc mô tả theo sơ đồ sau:

Hình 2: Mô tả quá trình tách chất trên cột sắc ký

2.6.1.2. Ưu điểm của ph-ơng pháp

Ph-ơng pháp sắc ký khí dùng để tách các hợp chất có thể bay hơi ở nhiệt độ cao mà không bị phân huỷ, kết quả phân tích sắc ký khí có thể cung cấp nhiều kết luận bổ ích về cấu trúc của các hợp chất.

Ph-ơng pháp sắc ký khí cho phép phân tích định tính và định l-ợng nhanh chóng các thành phần cũng nh- thực hiện việc tách, điều chế các hỗn hợp chất. A+E B+E E A B A B A B A + B

Khả năng tách của ph-ơng pháp sắc ký khí tốt, nhanh, nó có thể tách nhiều hỗn hợp mà các kỹ thuật khác (sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, cất phân đoạn) không giải quyết đ-ợc.

Kỹ thuật t-ơng đối đơn giản, dể vận hành, cho kết quả nhanh.

Độ nhạy của sắc ký khá cao. Các máy thông th-ờng có thể xác định đ-ợc đến 0,01% chất thử.

2.6.2. Ph-ơng pháp khối phổ

2.6.2.1. Bản chất của ph-ơng pháp

Khối phổ là ph-ơng pháp phân tích mà trong đó một hợp chất xét nghiệm đ-ợc ion hóa và phá thành các mảnh nhỏ trong thể khí d-ới dạng chân không cao (10-6mmHg). Sau quá trình ion hóa, các điện tích đó đ-ợc gia tốc trong điện tr-ờng và đ-ợc tách trong một từ tr-ờng theo c-ờng độ của các hạt.

Quá trình ion hóa đ-ợc thực hiện bằng cách cho một dòng electron có tốc độ cao va đập vào một mẫu hợp chất hữu cơ trong thể hơi và ion hóa hóa học.

Trong quá trình này thông th-ờng một (hoặc hai) electron của lớp ngoài bị bật ra khỏi phân tử và ion phân tử đ-ợc tạo thành.

M+ + 2e M + e

M2+ + 3e

Để tách 1 electron nh- vừa nói thì động năng của electron va đập ít nhất t-ơng ứng thế ion hóa của phân tử, tức là khoảng 8 - 15 eV.

Nếu trong quá trình đó một phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có năng l-ợng lớn (lớn hơn năng l-ợng cần thiết để ion hóa) thì khi đó phân tử đ-ợc chuyển giao nhiều năng l-ợng đến mức các ion phân tử đ-ợc hình thành bị phá ra thành các mảnh nhỏ gọi là quá trình phân mảnh. Trong quá

trình này 1 ion phân tử có thể phân huỷ thành một gốc tự do (Fo) và 1 ion d-ơng khác (F1+)

M+ Fo + F1+

Rồi các mảnh đó lại tiếp tục bị phá để cho ra một loạt các tiểu phân khác. Trong quá trình ion hóa nói trên, các ion phân tử hay các ion mảnh hoặc các tiểu phân không có điện tích (ví dụ gốc) đ-ợc -u tiến tạo thành tr-ớc.

D-ới những điều kiện đã cho xác suất tạo thành những ion có điện tích âm thấp hơn 104 lần.

Ph-ơng pháp phổ khối l-ợng dựa trên nguyên tắc chung là tách và đo khối l-ợng của tất cả các ion và ghi chúng trên một bản phổ. Sau đó dựa vào quy luật chung để phân tích thành phần các chất theo bản phổ ghi đ-ợc.

Về kỹ thuật, quá trình phân tích khối phổ phải đ-ợc thực hiện qua các b-ớc sau:

- Hóa khí mẫu phân tích. - Ion hóa mẫu.

- Tách các ion theo khối l-ợng. - Ghi nhận các ion.

- Xử lý số liệu.

Nói chung phổ khối l-ợng đ-ợc ghi lại d-ới dạng phổ vạch hoặc d-ới dạng các bảng trong đó c-ờng độ của các đỉnh đ-ợc đo bằng phần trăm so với các đỉnh có số khối l-ợng cao nhất của phổ (vì m/e  m) vì vậy đỉnh này t-ơng đ-ơng với khối l-ợng phân tử chính xác của hợp chất khảo sát.

Để đánh giá khối phổ của một hợp chất ch-a biết ta phải bắt đầu việc giải thích đỉnh có số khối l-ợng cao nhất. Các đỉnh của những mảnh bền hóa hơi là các đỉnh có khối l-ợng thấp.

Hình 3: Sơ đồ một khối phổ kế Mẫu chất Bản chân không Nam châm Tâm tăng tốc Nguồn electron Khe ra Bộ phận tiếp nhận ion

Phần 3

THựC NGHIệM

3.1. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị máy móc 3.1.1. Hóa chất 3.1.1. Hóa chất

Natrisunphat (Na2SO4) khan.

3.1.2. Dụng cụ

- ống sinh hàn xoắn ruộn gà, phiễu thuỷ tinh.

- Bình định mức cổ nhỏ loại 500ml, và loại 1000ml. - Nồi áp suất.

- Bếp ga mini, xilanh, rổ tre.

- Các lọ tiêu chuẩn để bảo quản tinh dầu.

3.1.3. Thiết bị máy móc

- Máy sắc ký (GC):

- Máy sắc ký khí - khối phổ liên hợp (GC/MS):

3.2. Địa điểm, thời gian lấy mẫu

Mẫu đinh lăng đ-ợc thu hái ở hái ở tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa.

- Mẫu thứ nhất (ký hiệu ĐL1): Thân và lá cây đinh lăng đ-ợc lấy ở ph-ờng Trung Đô, thành phố Vinh, Nghệ An.

+ Khối l-ợng 5kg.

+ Ngày lấy mẫu: 07/12/2009.

- Mẫu thứ hai (ký hiệu ĐL2): Thân và lá cây đinh lăng đ-ợc lấy ở thị trấn nông tr-ờng Thống Nhất, Yên Định, Thanh Hóa.

+ Khối l-ợng 5 Kg.

+ Ngày lấy mẫu: 10/12/2009.

Các mẫu thực vật đã đ-ợc ThS. Nguyễn Tiến C-ờng, bộ môn Thực vật, khoa Sinh học, tr-ờng Đại học Vinh định danh là đinh lăng lá nhỏ có tên khoa học Polyscias fruticosa (L.)Harms.

3.3. Tiến hành tách tinh dầu

Để tách tinh dầu đinh lăng ta sử dụng ph-ơng pháp cất lôi cuốn hơi n-ớc, với bộ dụng cụ gồm: nồi cất (nồi áp suất), ống sinh hàn, bình hứng lắp nh- hình 4.

Hình 4: Sơ đồ dụng cụ tách tinh dầu bằng ph-ơng pháp cất lôi cuốn hơi n-ớc

Mẫu cây t-ơi đ-ợc tiến hành ch-ng cất trong ngày. Quá trình ch-ng cất đ-ợc tiến hành nh- sau:

Cho 5 kg nguyên liệu vào nồi áp suất có lót rỏ tre d-ới đáy nồi để ngăn cách đáy nồi với nguyên liệu. Cho thêm vào nồi 3 lít n-ớc cất, vặn nắp nồi vừa phải, đủ kín để tránh hiện t-ợng tinh dầu bị phân hủy do nhiệt độ và áp suất trong nồi quá lớn. Đun nồi bằng bếp ga, khi n-ớc trong nồi áp suất sôi cần điều chỉnh nhiệt độ thích hợp sao cho tốc độ nhỏ giọt (gồm n-ớc và tinh dầu) khoảng 60 - 70 giọt/phút. Đồng thời theo dõi l-ợng tinh dầu thu đ-ợc theo thời gian. Khi thấy hàm l-ợng tinh dầu không tăng thêm nữa thì ngừng ch-ng cất. Tinh dầu nhẹ hơn n-ớc nổi lên trên ở phần cổ nhỏ, ta dùng bơm tiêm hút tinh dầu cho vào lọ làm khô bởi Na2SO4 khan. Sau đó hút tinh dầu vào lọ tiêu

chuẩn rồi cho vào tủ lạnh giữ ở nhiệt độ 5oC. Đọc thể tích tinh dầu thu đ-ợc và tính hàm l-ợng % so với mẫu t-ơi.

Không nên để hỗn hợp tinh dầu và n-ớc rơi từng giọt vào bình định mức mà hứng từ từ theo thành bình.

3.4. Định l-ợng tinh dầu

Sau khi ch-ng cất bằng lôi cuốn hơi n-ớc thu lấy tinh dầu, chúng tôi tiến hành xác định hàm l-ợng tinh dầu và thu đ-ợc kết quả nh- sau:

Bảng 1: Bảng định l-ợng tinh dầu cây đinh lăng ở TP Vinh - Nghệ An và Yên Định - Thanh Hóa

Mẫu Khối l-ợng (g) Thời gian ch-ng cất (phút) Tốc độ nhỏ giọt (giọt/phút) Thể tích tinh dầu (ml) Hàm l-ợng tinh dầu (%) ĐL1 5000 150 65 - 70 1,3 0,026 ĐL2 5000 150 60 - 70 1,4 0,028

Hàm l-ợng tinh dầu trong thân và lá cây đinh lăng thấp: Mẫu lấy ở thành phố Vinh - Nghệ An có hàm l-ợng 0,026%; còn mẫu lấy ở Yên Định - Thanh Hóa có hàm l-ợng 0,028%. Chúng không có sự khác biệt nhiều về hàm l-ợng tinh dầu.

3.5. Xác định thành phần hóa học của tinh dầu

Các mẫu tinh dầu đ-ợc phân tích trên máy sắc ký khí - khối phổ liên hợp (GC - MS) của hãng Agilent Technologies HP 6890N. Agilent Technologies HP 6890N/HP 5973 MSD đ-ợc lắp với cột tách mao quản và vận hành sắc ký với nhiệt độ buồng bơm mẫu 250oC. Nhiệt độ detectơ 260oC. Ch-ơng trình nhiệt độ buồng điều nhiệt: 60oC (2 min), tăng 4oC/min cho đến 220oC, dừng ở nhiệt độ này trong 10 min với He làm khí mang.

Việc xác nhận các cấu tử đ-ợc thực hiện bằng cách so sánh các dữ kiện phổ MS của chúng với phổ chuẩn đã đ-ợc công bố có trong th- viện Willey/Chemstation HP.

Phần 4

KếT QUả Và THảO LUậN

4.1. Tinh dầu cây đinh lăng ở thành phố Vinh - Nghệ An 4.1.1. Hàm l-ợng tinh dầu

Mẫu nghiên cứu là phần thân và lá cây đinh lăng (Polyscias fruticosa

(L.) Harms) đ-ợc thu hái vào lúc 8 giờ ngày 7 tháng 12 năm 2009 ở ph-ờng Trung Đô, thành phố Vinh, Nghệ An, với khối l-ợng 5kg.

Mẫu đ-ợc ch-ng cất bằng ph-ơng pháp cất lôi cuốn hơi n-ớc, tinh dầu thu đ-ợc là một chất lỏng màu vàng, trong suốt, nhẹ hơn n-ớc, không tan trong n-ớc, có mùi thơm đặc tr-ng, hàm l-ợng tinh dầu là: 0,026% so với khối l-ợng nguyên liệu t-ơi.

4.1.2. Xác định thành phần hóa học

Thành phần hóa học tinh dầu cây đinh lăng ở Nghệ An đ-ợc xác định bằng ph-ơng pháp sắc ký khí (GC) và sắc ký khí - khối phổ ký liên hợp (GC/MS). Sắc ký đồ GC đ-ợc trình bày ở hình 5.

Hỡnh 5: Sắc ký đồ của tinh dầu cõy đinh lăng ở phường Trung Đụ, thành phố Vinh, Nghệ An

Theo kết quả phân tích cho thấy thành phần hóa học của tinh dầu cây đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) là hỗn hợp nhiều chất trong đó có 15 hợp chất đã đ-ợc xác định. Kết quả đ-ợc trình bày ở bảng 2:

Bảng 2: Thành phần hóa học của tinh dầu cây đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) ở ph-ờng Trung Đô,

thành phố Vinh, Nghệ An STT Hợp chất Hàm l-ợng % 1 metylthymol ete 0,91 2  - tecpinen 0,73 3 ylangen 0,51 4  - copaen 0,24 5  - bourbonen 1,41 6  - elemen 2,37 7 gecmacren - D 24,84 8 - elemen 13,62 9 guaia - 3,7 - dien 1,04 10 iso leden 1,30 11  - caryophylen 2,77 12  - amophen 0,99 13  - farnesen 32,49 14 ∆ - cadinen 1,07 15 gecmacren - B 6,17 16 Ch-a xác định 3,58 17 Các chất khác 5,96

Từ bảng 2 ta thấy tinh dầu cây đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) ở ph-ờng Trung Đô, thành phố Vinh, Nghệ An có 15 hợp chất đã xác định chiếm 90,46%. Thành phần chính của tinh dầu chủ yếu là các hợp chất thuộc loại secquitecpen bao gồm  - farnesen (32,49%), gecmacren - D (24,84%),  - elemen (13,62%). Ngoài ra còn có một số hợp chất có thành hàm l-ợng t-ơng đối lớn nh-: gecmacren - B (6,17%) và một hợp chất ch-a xác định với hàm l-ợng 3,58%.

4.2. Tinh dầu cây đinh lăng ở Yên Định, Thanh Hóa 4.2.1. Hàm l-ợng tinh dầu

Mẫu nghiên cứu là phần thân và lá cây đinh lăng (Polyscias fruticosa

(L.) Harms) đ-ợc thu hái vào lúc 8 giờ ngày 10 tháng 12 năm 2009 tại thị trấn nông tr-ờng Thống nhất, Yên Định, Thanh Hóa, với khối l-ợng 5kg.

4.1.2. Xác định thành phần hóa học

Thành phần hóa học tinh dầu cây đinh lăng ở Thanh Hóa đ-ợc xác định bằng ph-ơng pháp sắc ký khí (GC) và sắc ký khí - khối phổ ký liên hợp (GC/MS). Sắc ký đồ GC đ-ợc trình bày ở hình 6.

Hình 6: Sắc ký đồ của tinh dầu cây đinh lăng ở thị trấn nông tr-ờng Thống nhất, Yên Định, Thanh Hóa

Bảng 3: Thành phần hóa học của tinh dầu cây đinh lăng

(Polyscias fruticosa (L.) Harms) ở thị trấn nông tr-ờng Thống Nhất, Yên Định, Thanh Hóa

STT Hợp chất Hàm l-ợng % 1 metylthymol ete 0,27 2  - tecpinen 1,43 3 ylangen 0,27 4  - bourbonen 0,7 5  - elemen 1,77 6 gecmacren - D 24,86 7  - elemen 14,29 8 guaia - 3,7 - dien 0,69 9  - caryophylen 0,74 10  - amophen 0,37 11  - farnesen 38,45 12 ∆ - cadinen 0,97 13 gecmacren - B 6,17 14  - cadien 0,13 15 Ch-a xác định 4,16 16 alloaromadendren 0,04 17 Các chất khác 4,42

Từ bảng 3 ta thấy tinh dầu cây đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) ở tại thị trấn nông tr-ờng Thống nhất, Yên Định, Thanh Hóa có 15 hợp chất đã xác định chiếm 91,42%. Thành phần chính của tinh dầu chủ yếu là các hợp chất thuộc loại secquitecpen bao gồm  - farnesen (38,45%), gecmacren - D (24,86%),  - elemen (14,29%). Ngoài ra còn có một số hợp chất có thành hàm l-ợng t-ơng đối lớn nh-: gecmacren - B (6,17%) và một