2.3.2.1Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học
Định tính các nhóm chất trong củ Hoàng Sin Cô bằng các thuốc thử thường quy [2].
18 ❖ Định tính alcaloid:
• Mẫu nghiên cứu:
Dược liệu: cân khoảng 1 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml có nút
mài, thêm 10 ml dung dịch H2SO4 1N, đun đến sôi, để nguội, lọc lấy dịch lọc. Cho
dịch lọc vào bình gạn 50 ml, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 1N đến pH = 9-10 (thử bằng chỉ thị màu vạn năng). Lắc với cloroform 2 lần (lần 1 x 10 ml, lần 2 x 5 ml), gạn lấy lớp cloroform. Gộp lấy dịch chiết cloroform, lắc dịch chiết với H2SO4 1N (2 lần x 5 ml), gạn lấy dịch chiết acid, chia dịch chiết này vào 3 ống nghiệm.
• Tiến hành:
- Ống 1: Nhỏ 2 - 3 giọt TT Mayer. Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng. - Ống 2: Nhỏ 2 - 3 giọt TT Dragendorff. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa da cam.
- Ống 3 : Nhỏ 2- 3 giọt TT Bouchardat. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa nâu đỏ.
❖ Định tính saponin
• Mẫu nghiên cứu:
Dược liệu: Cân khoảng 1 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm vào khoảng 20 ml ethanol 30%, đun cách thủy trong 5 phút và lọc nóng qua bông. Cho dịch chiết vào cốc có mỏ, bốc hơi dung môi trên cách thủy cho đến còn khoảng 5 ml. Dịch chiết này được sử dụng làm các phản ứng hóa học.
• Tiến hành:
- Hiện tượng tạo bọt:
Lấy 10 giọt dịch chiết trên cho chảy nhỏ giọt cho vào ống nghiệm lớn đã có sẵn 5 ml nước. Dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều đứng của ống nghiệm trong 1 phút (khoảng 30 lần). Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt. Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin.
19 - Phản ứng Liebermann – Burchard
Lấy 3 ml dịch chiết ở trên cho vào 1 chén sứ, cô cách thủy đến cắn, để nguội. Hòa tan cắn này bằng hỗn hợp gồm 1 ml anhydrid acetic và 1 ml cloroform, lọc nhanh qua bông lấy dịch trong cho vào 1 ống nghiệm khô. Để nghiêng ống nghiệm, dùng pipet hút khoảng 1 ml acid sulfuric đậm đặc cho chảy nhẹ nhàng dọc theo thành ống nghiệm, không lắc ống nghiệm.
Phản ứng dương tính khi mặt ngăn cách giữa 2 lớp chất lỏng có 1 vòng màu nâu đỏ, đỏ tím hay tím; lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá, xanh rêu hay nâu đỏ.
❖ Định tính flavonoid:
• Mẫu nghiên cứu:
Dược liệu: Cân khoảng 2 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml. Thêm 40 ml nước cất, đun sôi trong 2 phút. Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào bình gạn, để nguội. Thêm 10 ml ethyl acetat, lắc đều, để yên cho tách lớp, gạn lấy lớp ethyl acetat cho vào cốc có mỏ, cô cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn bằng 10 ml ethanol 90 % thu được dịch chiết để làm các phản ứng hóa học.
• Tiến hành:
- Phản ứng Cyanidin:
Cho 1 ml vào một ống nghiệm, thêm khoảng 10 mg bột magnesi kim loại, thêm 2-3 giọt HCl đặc, lắc đều, đun cách thủy 5 phút. Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ.
- Phản ứng với hơi amoniac (NH4OH):
Nhỏ 1-2 giọt dịch chiết lên một tờ giấy lọc, sấy nhẹ đến khô. Hơ lên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nắp. Phản ứng dương tính khi thấy màu vàng đậm dần lên.
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%:
Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5%. Phản
20
- Phản ứng với dung dịch kiềm:
Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 3-5 giọt dung dịch NaOH 10% sẽ xuất hiện kết tủa màu vàng. Thêm khoảng 1-2 ml nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch được tăng thêm.
- Phản ứng với thuốc thử Diazo
Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (NaOH,
KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha, lắc đều sẽ xuất hiện màu đỏ.
❖ Định tính coumarin:
• Mẫu nghiên cứu:
Dược liệu: 2 g bột dược liệu vào bình nón 50 ml. Thêm 10 ml ethanol 90%, đun cách thủy sôi trong vòng 3-5 phút. lọc nóng qua giấy lọc, dịch thu được đem làm các phản ứng định tính.
• Tiến hành:
- Phản ứng mở, đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch chiết: Ống 1: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10% Ống 2: Để yên.
Đun cả hai ống nghiệm đến sôi, để nguội, quan sát thấy: Ống 1: Xuất hiện tủa đục.
Ống 2: Trong suốt.
Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất. Lắc đều thấy: Ống 1: Trong suốt
Ống 2: Xuất hiện tủa đục.
Thêm vào ống 1 vài giọt dung dịch HCl đặc, ống 1 sẽ đục trở lại như ống 2 (phản ứng dương tính).
21
- Phản ứng Diazo hóa:
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm 2 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi, để nguội. Nhỏ từ từ từng gọt TT Diazo mới pha. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ cam.
- Phản ứng chuyển dạng Cis-Trans
Nhỏ vài giọt dịch lọc nên tờ giấy lọc, Nhỏ tiếp vào đó vài giọt dung dịch NaOH 5%, sấy cho khô. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại, rồi chiếu ánh sang tử ngoại ở bước sóng 366 nm trong khoảng 5 phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới ánh sáng tử ngoại sẽ thấy phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che. Tiếp tục chiếu ánh sáng tử ngoại sau vài phút sẽ thấy cả hai phần có huỳnh quang như nhau.
❖ Định tính glycosid tim
• Mẫu nghiên cứu:
Lấy 10 g bột dược liệu, cho vào bình nón 250 ml, thêm 100 ml ethanol 25%, ngâm 24 giờ. Gạn lấy dịch chiết vào cốc có mở, thêm 3 ml dung dịch chì acetat 30% cho đến dư (tủa hết), khuấy đều, lọc qua giấy lọc gấp nếp (thử lại dịch lọc đến khi không còn tủa với chì acetat). Lắc dịch lọc với cloroform-ethanol (4:1) (2 lần x 10 ml), gạn lớp cloroform vào một cốc có mỏ đã được sấy khô. Gộp các dịch chiết cloroform. Nếu dịch chiết còn lẫn nước thì lọc lại qua một lớp bông. Dịch chiết được cô đến còn khoảng 10 ml rồi chia vào các ống nghiệm nhỏ, cô tới cắn, dùng cắn này làm các phản ứng định tính.
• Phản ứng xác định khung steroid
- Phản ứng Liebermann – Burchard
Thêm vào 1 ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn, để nghiêng 45o, cho từ từ
theo thành ống 1 ml H2SO4 đặc.
Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng màu tím đỏ và chất lỏng phía dưới màu hồng, phía trên màu xanh lá.
22
• Phản ứng xác định vòng lacton 5 cạnh
- Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh: + Phản ứng Baljet
Thêm vào 0,5 ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết, nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (So sánh với ống chứng không có cắn glycosid tim).
Phản ứng dương tính khi ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng.
+ Phản ứng Legal
Thêm vào 0,5 ml ethanol 90%, lắc đều cho tan, thêm 1 giọt dung dịch Natri nitroprossiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10%, lắc đều (so sánh với ống chứng không có cắn glycosid tim).
Phản ứng dương tính khi ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng.
❖ Định tính anthranoid
- Định tính dạng anthranoid toàn phần
• Chiết xuất:
Cân khoảng 1 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 10 ml dung dịch acid sulfuric 1N, đun trực tiếp đến sôi. Lọc nóng vào trong bình gạn dung tích 50 ml, để nguội dịch lọc. Thêm 5 ml cloroform, lắc nhẹ và gạn lấy lớp cloroform. Lấy dịch chiết này để làm phản ứng định tính.
• Tiến hành:
Lấy 1 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1 ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Phản ứng dương tính nếu lớp kiềm có màu đỏ sim.
❖ Định tính acid hữu cơ, đường khử, acid amin, tanin, polysaccharid [3]:
• Mẫu nghiên cứu:
Cho 2 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 40 ml nước cất. Chiết với nước khoảng 2-3 phút, để nguội, lọc, lấy dịch lọc để làm phản ứng định tính.
23
• Tiến hành:
- Định tính acid hữu cơ:
Cho 2 ml dịch lọc vào 2 ống nghiệm, thêm vào ít bột Na2CO3. Phản ứng dương
tính khi có bọt khí nổi lên.
- Định tính đường khử:
Đun cách thủy 2 ml dịch lọc với 0,5 ml TT Fehling A, và Fehling B trong vài phút. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa đỏ gạch.
- Định tính acid amin:
Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 3 giọt TT Ninhydrin, đun cách thủy 2 - 3 phút. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu tím.
- Định tính tanin:
Lấy 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2 ml dịch lọc:
+ Ống 1: Thêm 2 giọt FeCl3 5%.
Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt. + Ống 2: Thêm 2 giọt chì acetat 10%.
Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa bông. + Ống 3: Thêm 5 giọt gelatin 1%.
Phản ứng dương tính khi xuất hiện xuất hiện tủa bông trắng
- Định tính polysaccharid:
Cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 2 giọt thuốc thử Lugol. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa màu xanh đen.
2.3.2.2Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng dịch chiết Hoàng Sin Cô và chất chuẩn
• Chuẩn bị mẫu
- Chuẩn bị dung dịch chấm sắc ký củ Hoàng Sin Cô:
Cân 2 g bột thô củ Hoàng Sin Cô vào bình nón có nút mài, chiết siêu âm với ethanol 70% (3 lần x 20 ml/lần x 30 phút), lọc, tập hợp các dịch lọc, cô dịch lọc tới
24
cắn. Phân tán cắn trong 30 ml nước cất, chiết lỏng-lỏng với ethyl acetat 3 lần, mỗi lần 10 ml. Gộp các dịch chiết ethyl acetat, cô cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn thu được trong 1 ml methanol thu được dịch chấm sắc ký lớp mỏng.
- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký lá Hoàng Sin Cô:
Cân 2 g bột thô lá Hoàng Sin Cô vào bình nón có nút mài, chiết siêu âm với ethanol 70% (3 lần x 20 ml/lần x 30 phút), lọc, tập hợp các dịch lọc, cô dịch lọc tới
cắn. Phân tán cắn trong 30 ml nước cất, chiết lỏng-lỏng với n-hexan 2 lần, mỗi lần
10 ml. Loại bỏ lớp n-hexan, lấy lớp nước và tiếp tục chiết lỏng-lỏng với ethyl acetat
3 lần, mỗi lần 10 ml. Gộp các dịch chiết ethyl acetat, cô cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn thu được trong 1 ml methanol thu được dịch chấm sắc ký lớp mỏng.
- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký thân Hoàng Sin Cô:
Cân 2 g bột thô thân Hoàng Sin Cô vào bình nón có nút mài, chiết siêu âm với ethanol 70% (3 lần x 20 ml/lần x 30 phút), lọc, tập hợp các dịch lọc, cô dịch lọc tới
cắn. Phân tán cắn trong 30 ml nước cất, chiết lỏng-lỏng với n-hexan 2 lần, mỗi lần
10 ml. Loại bỏ lớp n-hexan, lấy lớp nước và tiếp tục chiết lỏng-lỏng với ethyl acetat
3 lần, mỗi lần 10 ml.Gộp các dịch chiết ethyl acetat, cô cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn thu được trong 1 ml methanol thu được dịch chấm sắc ký lớp mỏng.
- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký hoa Hoàng Sin Cô:
Cân 1 g bột thô hoa Hoàng Sin Cô, ngâm trong ethanol 50% 72 giờ, lọc, cô dịch
lọc tới cắn. Hòa tan cắn thu được trong 1 ml methanol thu được dịch chấm sắc ký
lớp mỏng.
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
Các chất chuẩn acid caffeic, luteolin được hòa tan trong 1 ml methanol với lượng thích hợp để dùng làm dung dịch đối chiếu.
• Tiến hành:
- Điều kiện sắc ký:
25 + Pha động khảo sát trên các hệ dung môi sau:
(I) Toluen – ethyl acetat – acid formic (14:10:1) (II) Ethyl acetat- acid formic- nước (8:1:1) - Đưa mẫu lên bản mỏng:
+ Thiết bị Linomat 5 (CAMAG), điều khiển bằng phần mềm visionCATs. + Tốc độ phun: 150 nl/s.
+ Cỡ syringe: 100 μl.
+ Thể tích phun mẫu: dịch chiết thân, lá, hoa, củ Hoàng Sin Cô 10 μl; acid caffeic 3 μl; luteolin 3 μl.
- Triển khai: Bão hoà bình triển khai 20x10 trong 20 phút (giấy lọc). Sau đó đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi, đậy kín, để yên, quan sát quá trình chạy sắc ký đến khi vết dung môi cách mép trên bản mỏng khoảng 1 cm thì lấy bản mỏng ra, đánh dấu đường dung môi và để khô tự nhiên trong tủ hốt.
- Hiện màu:
Soi UV ở bước sóng 254 nm, 366 nm. Sau đó phun thuốc thử hiện màu NP/PEG rồi soi, chụp ảnh ở bước sóng 366 nm.
- Chụp ảnh sắc ký đồ: Buồng chụp ảnh TLC Visualizer. - Xử lý kết quả: Phần mềm visionCATs.
Sắc ký lớp mỏng định tính đường trong dịch chiết củ Hoàng Sin Cô
• Chuẩn bị mẫu
Cân 10 g bột thô củ Hoàng Sin Cô vào bình nón có nút mài, đun cách thủy với nước cất ở 80℃ (3 lần x 200 ml x 2 giờ), lọc, tập hợp các dịch lọc. Cô đặc dịch chiết đến còn 40 ml bằng máy cất quay ở 80℃. Cho thêm 160 ml ethanol ngâm qua đêm để tạo tủa, sau đó mang đi ly tâm để lấy phần dịch và loại tủa. Lấy phần dịch đi cô quay cho đến khi còn khoảng 40 ml, thu được dịch chấm sắc ký.
• Tiến hành
26 - Đưa mẫu lên bản mỏng
+ Thiết bị Linomat 5 (CAMAG), điều khiển bằng phần mềm visionCATs. + Tốc độ phun: 150 nl/s.
+ Cỡ syringe: 100 μl.
+ Thể tích phun mẫu: dịch chiết củ Hoàng Sin Cô 3 μl.
- Triển khai: Bão hoà bình triển khai 10 x10 trong 20 phút (giấy lọc). Sau đó đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi, đậy kín, để yên, quan sát quá trình chạy sắc ký đến khi vết dung môi cách mép trên bản mỏng khoảng 1 cm thì lấy bản mỏng ra, đánh dấu đường dung môi và để khô tự nhiên trong tủ hốt.
- Hiện màu: Soi UV ở bước sóng 254 nm, 366 nm. Sau đó hiện màu bằng thuốc thử acid sulfuric 10%, sấy bản mỏng ở nhiệt độ 110-120℃ rồi quan sát, chụp ảnh ở ánh sáng thường.
- Chụp ảnh sắc ký đồ: Buồng chụp ảnh TLC Visualizer. - Xử lý kết quả: Phần mềm visionCATs.
2.3.2.3Định lượng polyphenol toàn phần trong dược liệu
Bên cạnh thành phần carbohydrat với các fructooligosaccharid rất có giá trị, các hợp chất phenolic cũng là thành phần rất đáng chú ý trong củ Hoàng sin cô. Chúng tôi tiến hành định lượng polyphenol toàn phần bằng phương pháp Folin-Ciocalteu. Thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% được pha loãng với nước.
- Dung dịch mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 2,5 mg acid gallic chuẩn, hòa tan bằng methanol 80% trong bình định mức 25 ml, thêm methanol 80% vừa đủ đến vạch. Pha loãng để được dãy dung dịch chuẩn nồng độ 20 µg/ml, 40 µg/ml, 60 µg/ml, 80 µg/ml, 100 µg/ml.
- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu vào bình nón, chiết siêu âm với methanol 80% (5 lần x 10 ml/lần x 15-20 phút), lọc thu lấy dịch chiết. lấy chính xác 5 ml dịch chiết cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol 80% đến vạch thu được dung dịch thử.
27
- Tiến hành định lượng:
Hút 1 ml dung dịch thử vào bình định mức 10 ml, thêm 2,5 ml thuốc thử Folin- Ciocalteu 10% và để phản ứng trong 5 phút. Thêm 1 ml nước cất lắc đều, thêm 4 ml
dung dịch Na2CO3 7,5%, định mức bằng nước cất hai lần. Sau 60 phút phản ứng ở
nhiệt độ phòng, xác định độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 754,5 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Giá trị A được ghi nhận và tiến hành xây dựng đường tuyến tính để xác định hàm lượng polyphenol toàn phần.
Hàm lượng polyphenol toàn phần có trong dược liệu được tính theo công thức: 𝑋 = 𝐶 𝑥 10−3 𝑥 𝑉 𝑥 𝐾
𝑚𝑑𝑙 𝑥 (100−𝑎)𝑥10−2 (mg GAE/g dược liệu) Trong đó:
X: Hàm lượng polyphenol toàn phần của mẫu thử (mg GAE/g dược liệu)