Kết quả sắc ký lớp mỏng dịch chiết các bộ phận của cây Hoàng Sin Cô triển khai với các hệ dung môi đã chọn được trình bày trong hình 3.9, 3.10 và bảng 3.2, 3.3.
❖ Hệ dung môi (II) ethyl acetat- acid formic- nước (8:1:1).
Sắc ký đồ sau khi triển khai được chụp ảnh ở bước sóng 254 nm và 366 nm, sau đó được hiện màu bằng thuốc thử NP/PEG và chụp ảnh ở bước sóng 366 mn (Hình 3.9). Kết quả phân tích được trình bày trong bảng 3.2.
(a) (b) (c)
Hình 3.9. Sắc ký đồ dịch chiết Hoàng Sin Cô triển khai với hệ dung môi (II) ethyl
acetat- acid formic- nước (8:1:1) quan sát ở: (a) UV 254 nm trước khi phun thuốc thử NP/PEG, (b) UV 366 nm trước khi phun thuốc thử NP/PEG, (c) UV 366 nm
sau khi phun thuốc thử NP/PEG
40
Bảng 3.2. Kết quả SKLM dịch chiết Hoàng Sin Cô triển khai với hệ dung môi (II)
ethyl acetat- acid formic- nước (8:1:1) quan sát ở UV 366 nm sau khi phun thuốc thử NP/PEG Rf Màu sắc huỳnh quang Mẫu Lá Củ Hoa Thân 0,14 xanh dương + + 0,2 xanh dương ++ ++ ++ 0,28 xanh dương ++ 0,3 vàng ++ 0,32 xanh lục sáng + ++ 0,34 xanh dương ++ 0,38 xanh lam ++ 0,47 vàng cam + ++ 0,48 vàng cam ++ 0,51 vàng cam ++ 0,58 xanh dương sáng +++ 0,6 vàng +++ 0,66 vàng ++ 0,72 vàng +++ 0,77 vàng + +++ 0,81 vàng + 0,85 xanh dương sáng ++ 0,86 xanh lục sáng ++ ++ 0,87 vàng cam ++ 0,89 xanh dương sáng ++ 0,91 vàng cam +++ 0.94 đỏ +++ (+): Có vết (++) : Vết đậm (+++) : Vết rất đậm Nhận xét
Trên sắc ký đồ ở bước sóng 366 nm sau khi phun thuốc thử, dịch chiết của các mẫu đều quan sát thấy các vết tách rõ.
Tại vị trí Rf = 0,77; Rf =0,86 cả sắc ký đồ của củ và hoa đều có vết phát huỳnh
41
Bên cạnh đó, tại vị trí Rf = 0,20 có vết tương đồng về màu sắc và vị trí ở cả sắc
ký đồ của củ, hoa và thân.
Sắc ký đồ của hoa cho nhiều vết với màu sắc khác nhau, cường độ các vết đậm. Như vậy, nhìn chung sắc ký đồ dịch chiết của lá, củ, hoa và thân Hoàng Sin Cô triển khai với hệ dung môi ethyl acetat- acid formic- nước (8:1:1) chỉ có một vài vết tương đồng, còn hầu hết các vết khác nhau về về màu sắc, vị trí, cường độ vết.
❖Với hệ dung môi (I) toluen - ethyl acetat- acid formic (14:10:1), các chất đối
chiếu acid caffeic và luteolin được sử dụng.
Sắc ký đồ sau khi triển khai được chụp ảnh ở bước sóng 254 nm và 366 nm, sau đó được hiện màu bằng thuốc thử NP/PEG và chụp ảnh ở bước sóng 366 mn (Hình 3.10). Kết quả phân tích được trình bày trong bảng 3.3.
(a) (b) (c)
Hình 3.10. Sắc ký đồ dịch chiết Hoàng Sin Cô và chất chuẩn triển khai với hệ dung
môi (I) toluen - ethyl acetat- acid formic (14:10:1) quan sát ở: (a) UV 254 nm trước khi phun thuốc thử NP/PEG, (b) UV 366 nm trước khi phun thuốc thử NP/PEG, (c)
UV 366 nm sau khi phun thuốc thử NP/PEG
( L: dịch chiết lá, C: dịch chiết củ, Ca: acid caffeic, Lu: luteolin, H: dịch chiết hoa, T: dịch chiết thân )
42
Bảng 3.3. Kết quả SKLM dịch chiết Hoàng Sin Cô và chất chuẩn triển khai ở hệ
dung môi toluen - ethyl acetat- acid formic (14:10:1) quan sát ở UV 366 nm sau khi phun thuốc thử NP/PEG
Mẫu Số
vết
Rf và màu sắc huỳnh quang Chất được xác
định
Lá 4 0,01; 0,33 (xanh lam); 0,4; 0,5 (xanh) Acid caffeic
Củ 5 0,007; 0,07; 0,33 (xanh lam); 0,5; 0,81
(xanh)
Acid caffeic
Hoa 8 0,008; 0,03; 0,09; 0,15; 0,33 (xanh lam);
0,42; 0,93 (đỏ); 0,6 (vàng)
Acid caffeic
Thân 8 0,01; 0,07; 0,3 (xanh); 0,32 (vàng); 0,34;
0,42; 0,7 (đỏ); 0,82 (xanh)
Luteolin
Acid caffeic 1 0,33 (xanh lam)
Luteolin 1 0,32 (vàng)
Nhận xét
Trên sắc ký đồ ở bước sóng 366 nm sau khi phun thuốc thử, dịch chiết của các mẫu đều quan sát thấy các vết tách rõ.
Tại vị trí Rf = 0,33, cả sắc ký đồ của dịch chiết lá, củ, hoa đều có vết tương đồng
với vết acid caffeic chuẩn, cường độ vết acid caffeic trong sắc ký đồ của hoa đậm hơn.
Trên sắc ký đồ của dịch chiết thân xuất hiện vết phát huỳnh quang màu vàng, có
vị trí tương đồng với vết luteolin chuẩn ở Rf = 0,32.
Qua quan sát trên sắc ký đồ có thể thấy trong lá, củ và hoa có sự xuất hiện của acid caffeic, trong thân có sự xuất hiện của luteolin. Ngoài ra, sắc ký đồ của lá và củ có nhiều điểm tương đồng, tuy nhiên cường độ các vết ở lá đậm hơn. Sắc ký đồ của hoa và thân cũng có nhiều vết tương đồng.
43
❖Kết quả sắc ký lớp mỏng củ Hoàng Sin Cô với hệ dung môi ethyl acetat-
propanol- nước- acid acetic băng (1:1:0.5:0.5) được trình bày ở hình 3.11.
Sắc ký đồ sau khi triển khai được chụp ảnh ở bước sóng 254 nm và 366 nm, sau đó được hiện màu bằng thuốc thử acid sulfuric 10% và chụp ảnh ở ánh sáng thường (Hình 3.11).
(a) (b) (c)
Hình 3.11. Sắc ký đồ dịch chiết củ Hoàng Sin Cô quan sát ở: (a) UV 254 nm trước
khi phun thuốc thử acid sulfuric 10%, (b) UV 366 nm trước khi phun thuốc thử acid sulfuric 10%, (c) ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử acid sulfuric 10%
Nhận xét
Sắc ký đồ sau khi phun thuốc thử acid sulfuric 10% quan sát ở ánh sáng thường
cho các vết tách nhau rõ. Dịch chiết củ cho 9 vết màu nâu đen lần lượt ở Rf = 0,07;
0,09; 0,11; 0,15; 0,20; 0,25; 0,35; 0,50; 0,56. Trong đó, với Rf càng lớn thì cường độ
các vết càng đậm hơn. Các vết này có thể là của các hợp chất đường đã biết trong củ Hoàng Sin Cô. Tuy nhiên do chưa có các chất đối chiếu nên tạm thời chúng tôi chưa xác định được các thành phần đường cụ thể.
44
Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn diện tích pic sắc ký của dịch chiết củ Hoàng Sin Cô 3.3.Định lượng polyphenol toàn phần trong dược liệu
Xây dựng đường chuẩn định lượng
Lần lượt lấy 1 ml dung dịch chuẩn acid gallic nồng độ 20 µg/ml, 40 µg/ml, 60 µg/ml, 80 µg/ml, 100 µg/ml cho vào bình định mức 10ml. Sau đó thêm 2,5 ml thuốc thử Folin- Ciocalteu 10% và để phản ứng trong 5 phút. Thêm 1ml nước cất lắc đều,
thêm 4 ml dung dịch Na2CO3 7,5%, định mức bằng nước cất. Lắc đều thu được dãy
chuẩn G1 đến G5 có nồng độ lần lượt là 2 µg/ml, 4 µg/ml, 6 µg/ml, 8 µg/ml, 10 µg/ml. Sau 60 phút phản ứng ở nhiệt độ phòng, xác định độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 745,5 nm. Mẫu trắng được chuẩn bị song song. Kết quả độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn (Bảng 3.2) và đồ thị tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ acid gallic chuẩn (Hình 3.12) như sau:
45
Bảng 3.4 Kết quả đo độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn G1 (2µg/ml) G2 (4µg/ml) G3 (6µg/ml) G4 (8µg/ml) G5 (10µg/ml) Độ hấp thụ A trung bình 0,183 0,381 0,543 0,76 0,917
Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ acid gallic chuẩn
Kết quả định lượng
Có sự phụ thuộc tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ acid gallic chuẩn với hệ
số tương quan R2= 0,9979.
Dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0,0923x + 0,0027 và mdl = 1,0023
g; mật độ quang A = 0,650; hàm ẩm a = 6,40 %; hệ số pha loãng K= 20; thể tích V = 50 ml ta xác định được hàm lượng polyphenol toàn phần là 7,475 (mg GAE/g dược liệu khô) y = 0.0923x + 0.0027 R² = 0.9979 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0 2 4 6 8 10 12 Độ h ấp th ụ A
46
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1.Về đặc điểm thực vật
Các đặc điểm hình thái của cây được nghiên cứu, so sánh với các đặc điểm được mô tả dựa theo các tài liệu. Qua phân tích, nhóm nghiên cứu đã xác định mẫu cây
nghiên cứu có tên khoa học là Smallanthus sonchifolius (Poepp.) H.Rob., họ Cúc
(Asteraceae).
Một số đặc điểm thực vật nổi bật của loài: thân mọc thẳng hình trụ, có lông bao phủ; lá gốc hình mác, chóp nhọn, mép có răng cưa, hai mặt lá có lông; thân rễ phân nhánh, củ hình trụ; cụm hoa ngù đầu gồm 7-8 cụm hoa đầu, màu vàng cam. Từ các đặc điểm thực vật nghiên cứu góp phần tạo cơ sở dữ liệu để kiểm nghiệm dược liệu và có thể phân biệt được cây Hoàng Sin Cô với các loài khác trong chi.
4.2.Về đặc điểm vi học
- Đặc điểm vi phẫu thực vật: cả thân và lá đều có lông che chở đa bào bao phủ bên ngoài, ngoài ra lá còn có lông tiết và ở phiến lá có mạch dẫn.
- Đặc điểm bột: tương tự vi đặc điểm vi phẫu, bột dược liệu cũng có lông tiết và lông che chở. Ngoài ra, bột lá còn có tinh thể canxi oxalat hình trụ, bột thân có tinh thể canxi oxalat hình cầu gai và mảnh mang màu. Bột hoa có hạt phấn hoa hình cầu, bề mặt có gai; bột rễ củ có nhiều hạt tinh bột.
Qua quá trình thực nghiệm đã cho kết quả hình ảnh và mô tả chi tiết vi phẫu thực vật cũng như đặc điểm bột, nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu trong việc phân biệt và xây dựng tiêu chuẩn kiểm kiệm dược liệu.
4.3.Về thành phần hóa học
Kết quả nghiên cứu định tính dược liệu bằng phản ứng hóa học sơ bộ cho thấy trong dịch chiết Hoàng Sin Cô có saponin, flavonoid, đường khử, acid hữu cơ, acid amin, polysaccharid. Dựa vào mức độ phản ứng có thể thấy thành phần chủ yếu trong dược liệu là flavonoid và đường khử. Kết quả thu được là phù hợp với những nghiên cứu về thành phần hóa học đã được đề cập trong phần tổng
47
quan. Do vậy nhóm nghiên cứu đã tiến hành định tính bằng sắc ký lớp mỏng và định lượng hàm lượng polyphenol toàn phần trong dược liệu.
Polyphenol là chất chuyển hóa thứ cấp trong thực vật, có liên quan đến nhiều tác dụng sinh học của dược liệu. Theo các nghiên cứu trước cho thấy polyphenol trong Hoàng Sin Cô có tác dụng chống oxy hóa, chống tăng đường huyết. Trong nghiên cứu này, polyphenol toàn phần được định lượng bằng phương pháp đo quang UV-Vis, các hợp chất phenol được cho phản ứng lên màu với Folin – Ciocalteu. Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và phổ biến, đã được nhiều nghiên cứu. Kết quả định lượng cho thấy hàm lượng polyphenol toàn phần trong
Hoàng Sin Cô là 7,475 (mg GAE/g dược liệu khô). Kết quả này bước đầu góp phần
vào việc xây dựng tiêu chuẩn cho mẫu nghiên cứu, định hướng cho các nghiên cứu hóa học sâu hơn.
Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu cũng tiến hành định tính thành phần hóa học bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Đây là một phương pháp thường quy được dùng trong kiểm nghiệm dược liệu. Qua quá trình khảo sát một số hệ dung môi, nhóm nghiên cứu nhận thấy 2 hệ có khả năng tách, bao gồm hệ I: toluen-ethyl acetat- acid formic (14:10:1) và hệ II: ethyl acetat - acid formic – nước (8:1:1). Từ kết quả sắc ký đồ cho thấy có thể phân biệt sắc ký đồ của lá, thân, củ, hoa dựa vào số lượng, vị trí, màu sắc các vết. Tuy nhiên có thể thấy sắc ký đồ của lá và củ có nhiều vết tương đồng và sắc ký đồ của hoa và thân có nhiều vết tương đồng về vị trí, màu sắc. Ngoài ra, khi so sánh với chất chuẩn cũng cho vết có màu sắc, vị trí tương đồng với chất chuẩn. Từ đó có thể thấy được sự xuất hiện của acid caffeic trong dịch chiết lá, củ và luteolin trong thân Hoàng Sin Cô. Acid caffeic được biết đến nhiều với tác dụng chống oxy hóa, giảm stress oxy hóa và loại bỏ các gốc tự do gây cảm ứng bệnh tiểu đường. Luteolin cũng là một hợp chất có nhiều tác dụng sinh học như chống viêm, chống dị ứng, chống oxy hóa, có hoạt tính chống ung thư. Tác dụng chống oxy hóa của Hoàng Sin Cô liên quan đến sự xuất hiện của acid caffeic và luteolin. Rễ củ Hoàng Sin Cô
48
dự trữ một lượng lớn carbohydrat, thành phần chính của carbohydrat này là oligofructan hoặc fructooligosaccharid, ngoài ra còn có glucose, fructose và sucrose [18]. Nhóm nghiên cứu cũng tiến hành sắc ký lớp mỏng riêng dịch chiết củ để sơ bộ xác định đường trong Hoàng Sin Cô. Qua tham khảo một số tài liệu, chúng tôi lựa chọn cách chiết củ Hoàng Sin Cô như trong nghiên cứu của Zhen-Yuan và cộng sự [47], sử dụng hệ dung môi ethyl acetat- propanol- nước- acid acetic băng (1:1:0.5:0.5) [34]. Kết quả sắc ký cho thấy có nhiều vết, thể hiện trong dịch chiết củ Hoàng Sin Cô có nhiều loại carbohydrat. Do điều kiện đề tài không có các chất chuẩn đối chiếu nên chưa thể xác định các chất tương ứng với các vết. Bên cạnh đó, với các
vết có Rf càng lớn thì cường độ vết càng đậm, có thể dự đoán các đường có tính phân
49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Sau một thời gian thực nghiệm, khóa luận đã thu về được một số kết quả sau:
❖ Về đặc điểm thực vật
- Đã mô tả và phân tích đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu. Căn cứ vào các
đặc điểm hình thái, mẫu nghiên cứu đã được giám định tên khoa học là Smallanthus
Sonchifolius (Poepp.) H.Rob. (tên thường gọi là Hoàng Sin Cô, Yacon, Khoai Sâm…), thuộc họ Cúc (Asteraceae).
- Đã mô tả đặc điểm vi phẫu thân, vi phẫu lá, đặc điểm bột góp phần vào tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu sau này.
❖ Về thành phần hóa học
- Đã định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp bằng các phản ứng hóa học, kết quả sơ bộ cho thấy mẫu nghiên cứu có chứa: flavonoid, saponin, đường khử, acid hữu cơ, acid amin và polysaccharid.
- Đã định tính dịch chiết các bộ phận lá, củ, hoa và thân của Hoàng Sin Cô bằng sắc ký lớp mỏng và so sánh với chất chuẩn acid caffeic và luteolin.
- Đã định tính sơ bộ carbohydrat trong dịch chiết củ Hoàng Sin Cô.
- Đã định lượng hàm lượng tổng polyphenol toàn phần trong dịch chiết dược liệu cho kết quả 7,475 (mg GAE/g dược liệu khô).
Kiến nghị
Trong điều kiện thời gian và khả năng cho phép, bước đầu đề tài đã thu được một số kết quả, góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu về cây Hoàng Sin Cô ở Việt Nam. Để đầy đủ hơn, cây Hoàng Sin Cô cần được nghiên cứu hơn về thành phần hóa học và tác dụng sinh học.
Nhóm nghiên cứu đề xuất một số ý kiến cho các đề tài sau:
- Nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và phân lập các hợp chất có hoạt tính sinh học của Hoàng Sin Cô.
50
- Nghiên cứu về tác dụng sinh học của Hoàng Sin Cô như tác dụng hạ đường huyết, tác dụng chống oxy hóa, chống viêm…
Tài liệu tham khảo Tài liệu Tiếng Việt
1. Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2016), Thực vật dược, NXB Y học, tr. 17-423.
2. Bộ môn Dược liệu (2019), Thực tập dược liệu, Trung tâm thư viện Đại học
Dược Hà Nội, tr. 64-133.
3. Đỗ Quyên (2015), Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ thiên nhiên, NXB
Giáo dục Việt Nam, Hà Nội, tr. 21-59.
4. Nguyễn Viết Thân (2020), Cây thuốc Việt Nam và những bài thuốc thường
dùng, NXB Y Học, Hà Nội, tr. 234.
5. Nguyễn Viết Thân (2003), Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi,
NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 13-21.
Tài liệu Tiếng Anh
6. Aybar Manuel, Riera Alicia, et al. (2001), "Hypoglycemic effect of the water
extract of Smallanthus sonchifolius (Yacon) leaves in normal and diabetic rats",
Journal of Ethnopharmacology, 74, pp. 125-132.
7. Baroni Silmara, Rocha Bruno, et al. (2016), "Hydroethanolic extract of
Smallanthus sonchifolius leaves improves hyperglycemia of streptozotocin induced neonatal diabetic rats", Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 9, pp. 432-436.
8. Baroni Silmara, Suzuki-Kemmelmeier Fumie, et al. (2008), "Effect of crude
extracts of leaves of Smallanthus sonchifolius (yacon) on glycemia in diabetic rats",
Revista Brasileira De Ciencias Farmaceuticas - RBCF, 44, pp. 522-527.
9. Cao Y., Ma Z. F., et al. (2018), "Phytochemical Properties and Nutrigenomic