3. Nội dung nghiên cứu
2.2.7.Phương pháp định tính cao chiết
2.2.7.1. Định tính polyphenol
Phản ứng với muối sắt (III): Sử dụng thuốc thử là dung dịch muối sắt (III); Tiến hành: Lấy 5 ml dịch thử (dịch chiết bằng ethanol) cho vào 2 ống nghiệm ký hiệu lần lượt là I và II. Cho thêm 0,5 ml muối sắt (III) vào ống II và quan sát hiện tượng. Tùy theo số lượng và vị trí nhóm hydroxyl trong phân tử polyphenol mà cho màu lục, xanh hoặc nâu.
Phản ứng với H2SO4 đặc: Sử dụng thuốc thử là dung dịch H2SO4 đặc; Tiến hành: Lấy 2 ml dịch thử (dịch chiết bằng ethanol) vào 2 ống nghiệm ký hiệu lần lượt là I và II. Cho thêm 1-2 giọt H2SO4 đặc vào ống II và quan sát hiện tượng. Khi nhỏ H2SO4 đặc lên các dẫn xuất của flavon và flavonol thì cho màu vàng đậm; đối với chalcon và auron cho màu đỏ, đỏ thắm và đỏ tươi; flavanon cho màu đỏ da cam do sự chuyển thành chalcon [4].
2.2.7.3. Định tính các flavonoid
Sử dụng thuốc thử là dung dịch axit HCl đặc và bột Mg kim loại. Tiến hành: Lấy 0,05 g cặn chiết ethanol vào ống nghiệm và thêm 10 ml CH3OH lắc đều, đun nóng ống nghiệm cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2 ml dịch đã lọc vào 2 ống nghiệm ký hiệu lần lượt là I và II. Thêm một ít bột Mg kim loại vào cả 2 ống, lắc đều và cho 5 giọt HCl đặc vào ống II, đun trong bình cách thuỷ vài phút và quan sát thấy dung dịch có màu từ vàng, đỏ đến xanh là dương tính với các flavonoid [4].
2.2.7.4. Định tính các coumarin
Định tính coumarin được thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Thái An và Bùi Thế Hùng (2008) sử dụng thuốc thử là dung dịch NaOH 10%. Tiến hành: Lấy 2 ml dịch thử (dịch chiết bằng ethanol) vào 2 ống nghiệm ký hiệu lần lượt là I và II. Cho vào ống II 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cả 2 ống trên bếp cách thủy đến sôi, lấy ra để nguội cho thêm 4 ml nước cất vào cả 2 ống I và II. Quan sát thấy chất lỏng ở ống II (có kiềm) trở lên trong suốt hoặc trong hơn ống A (không kiềm) có thể xem là có coumarin. Nếu đem axit hóa ống nghiệm có kiềm bằng một vài giọt HCl đặc mà làm cho dịch mất màu vàng đục hoặc xuất hiện kết tủa bông (cũng có khi xuất hiện kết tủa) thì có thể kết luận có coumarin [12].
2.2.7.5. Phương pháp sắc ký lớp mỏng( TLC)
Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng là kỹ thuật phân bố rắn - lỏng. Trong đó, chất lỏng được đi xuyên qua một lớp chất hấp thụ trơ như silicagel hoặc nhôm oxit, chất hấp thụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm, hoặc tấm plastic được gọi là pha động.
Sử dụng bản mỏng TLC silicagel 60 F254 của hãng Merck được cắt bằng kéo thành bản hình chữ nhật có kích thước 3,5 cm x 1,0 cm. Sử dụng ống mao quản để đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch. Ðường xuất phát cách mép dưới của bản mỏng 0,7 cm. Bình khai triển là bình thủy tinh hình trụ cao 9 cm, đường
kính miệng 5 cm, có nắp đậy kín. Rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình. Lượng dung môi dày khoảng 3-5 mm ở đáy bình. Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển. Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn khoảng 2/3 bản, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng. Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% rồi sấy khô trên bếp điện đến khi hiện màu [14].
Hệ dung môi triển khai sắc kí được sử dụng: n-hexan:acetone tỉ lệ 1:1; Dichlomethane:n-hexan tỉ lệ 2:1.