3. Nội dung nghiên cứu
2.2.9. Phương pháp xử lý và phân tích kết quả
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để thống kê số liệu. Các số liệu được xử lý bằng phương pháp xác suất thống kê. Giá trị trung bình: X=∑ xi / n
Phương sai: S2 = ∑( xi – x)2 / (n-1) Độ sai chuẩn: Sx= S/√-
Sai số tuyệt đối: ∆x = t(α,ƒ).Sx Kết quả: x= x ± ∆x
Khoảng giới hạn tin cậy: x = t (α,ƒ).Sx
Trong một số trường hợp còn tính sai số tương đối: A= ∆x. 100/x Trong đó:
xi: giá trị số liệu thực nghiệm x: trung bình cộng
n: số lần thí nghiệm
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc điểm hình thái, giải phẫu của loài Adinandra bockiana
3.1.1. Đặc điểm hình thái của loài Adinandra bockiana
Mẫu cây A. bockiana thu tại xã Liêm Phú, huyện Văn Bàn, tỉnh Lào Cai ở độ cao 1200-1800 m, tọa độ 21°59’15’’N và 104°19’28’’E được chúng tôi mô tả đặc điểm hình thái ngoài các bộ phận của thân, cành, lá, hoa và quả.
Kết quả hình 3.1 cho thấy, loài A. bockiana là cây thân gô cao khoảng 7-9 m, tiết diện thân tròn, thân non màu xanh lục, già màu nâu đậm, nhẵn. Cành non gần tròn và nhẵn. Lá đơn, mọc cách, không có lá kèm. Gân lá hình lông chim và có từ 4-7 cặp gân phụ. Lá hình thuôn dài, gốc lá nhọn, đầu lá nhọn, mép lá nguyên không chia thùy. Kích thước lá trưởng thành khoảng 5-7 cm. Mặt trên lá màu lục đậm, mặt dưới màu xanh lục nhạt. Hoa đơn độc, mọc ở nách lá hoặc đầu cành hoặc ở thân. Có từ 3-4 hoa ở cùng 1 nách lá. Nụ hoa khi còn nhỏ có màu xanh lục nhạt, khi nở có màu trắng sữa. Cây ra hoa vào khoảng tháng tám, tháng chín hằng năm. Quả chín vào khoảng tháng mười một, tháng mười hai.
Loài A. bockiana là cây thân gô lớn và thường mọc sâu vào lòng đất ở sườn các dãy núi nên trong các đợt đi thu mẫu, phần rễ của cây chúng tôi không thu được để tiến hành quan sát. Vì vậy, đặc điểm hình thái rễ của loài A. bockiana
chưa được chúng tôi mô tả.
So sánh với mô tả của Pritzel (1900)[28] về loài A .bockiana trồng tại Trung Quốc, chúng tôi nhận thấy loài A. bockiana thu tại xã Liêm Phú, huyện Văn Bàn, tỉnh Lào Cai trong nghiên cứu này có đặc điểm hình thái và màu sắc của thân cây, lá cây, cách phân cành, hoa và quả với là khá tương đồng nhau.
3.1.2. Đặc điểm giải phẫu của loài Adinandra bockiana
3.1.2.1. Giải phẫu cắt ngang thân cây
Đặc điểm giải phẫu cắt ngang thân của loài A. bockiana được mô tả từ ngoài vào trong gồm các phần như hình 3.2. Ngoài cùng là lớp biểu bì (1) được hình thành từ lớp nguyên bì của mô phân sinh ngọn, gồm một lớp tế bào sống, không chứa diệp lục, thực hiện chức năng bảo vệ. Biểu bì thân gồm những tế bào hơi kéo dài dọc theo thân và ít lô khí. Lớp mô dày (2) nằm sát biểu bì, gồm các tế bào sống có vách hóa dày không đều, hình tròn hoặc hình trứng, tế bào dài ra khi cây phát triển. Mô dày có chức năng nâng đỡ và bảo vệ cho cây. Lớp mô mềm vỏ (3) nằm phía trong mô dày, gồm các tế bào có kích thước lớn, sắp xếp tạo các khoảng trống gian bào khá lớn. Mô mềm vỏ có chứa diệp lục tạo nên màu lục của thân non. Ngoài ra chúng còn chứa tinh bột, protein, lipit. Mô mềm có chức năng quang hợp, bài tiết, nâng đỡ và dự trữ.
Vòng mô cứng (4) là các tế bào có màng dày hóa gỗ, bắt màu xanh của thuốc nhuộm xanh methylen. Các tế bào rất khác nhau về hình dạng, cấu tạo và tính chất. Khi trưởng thành, nội chất tiêu biến, gồm những tế bào chết. Các tế bào tập trung thành từng đám mô cứng xếp gần như liên tục tạo thành một vòng, đảm nhiệm chức năng cơ học. Phần Libe (5) được hình thành từ lớp tế bào ngoài của tầng phát sinh, gồm những tế bào hình đa giác, xếp sít nhau, bắt màu hồng của thuốc nhuộm carmine, có màng mỏng; các tế bào libe phân hóa hướng tâm. Tầng phát sinh (6) gồm các tế bào sống, có hình chữ nhật hơi dài. Các tế bào của tầng phát sinh trụ phân chia theo hướng tiếp tuyến trong cho gô thứ cấp và phân chia theo hướng tiếp tuyến ngoài cho libe thứ cấp.
Phần Gô (7) được hình thành ở phía trong tầng phát sinh trụ và tạo thành vòng liên tục, gồm 5-6 lớp tế bào chết, bắt màu xanh của thuốc nhuộm xanh methylen. Hệ dẫn của thân gồm gô và libe phát triển thành vòng liên tục, phần gô phát triển với nhiều mạch gô và mô mềm gỗ, mạch có hình đa giác xen lẫn với các tế bào mô mềm gô bao quanh (dạng mô mềm quanh mạch). Mạch gô có kích thước lớn với đường kính khoảng 12µm. Phần mô mềm ruột (8) nằm ở phần giữa thân gồm các tế bào hình đa giác có kích thước khác nhau. Tinh thể canxi oxalate (9) được hình thành trong tế bào mô mềm, tinh thể thường lấp đầy toàn bộ tế bào, thậm chí còn làm biến dạng tế bào. Tinh thể bắt màu xanh của thuốc nhuộm xanh metylen.
3.1.2.2. Giải phẫu cắt ngang lá cây
Cấu tạo giải phẫu cắt ngang lá cây của loài A.bockiana đi từ ngoài vào trong bao gồm các phần được chú thích ở hình 3.3. Lớp biểu bì trên (1) là những tế bào hình chữ nhật, không có lục lạp. Vách tế bào biểu bì có tầng cutin dày có tác dụng bảo vệ lá và giảm sự thoát hơi nước, không có hoặc có ít lô khí. Lớp mô giậu (2) nằm tiếp với biểu bì trên gồm một đến nhiều lớp tế bào hình chữ nhật dài, xếp sát nhau chừa lại các khoảng gian bào rất nhỏ, các tế bào chứa nhiều lục lạp thích nghi với quá trình quang hợp. Lớp mô xốp (3) nằm dưới mô giậu và tiếp với biểu bì dưới, gồm 4-5 lớp tế bào đa giác cạnh tròn, không đều, sắp xếp rời rạc tạo nên nhiều khoảng trống chứa khí, thực hiện chức năng trao đổi khí giữa cây với môi trường. Lớp biểu bì dưới (4) là các tế bào hình chữ nhật xếp xít nhau, không chứa lục lạp nhưng tầng cutin ở biểu bì dưới mỏng hơn so với biểu bì trên, có nhiều lô khí hơn.
Vòng mô cứng (5) là các tế bào có màng dày hóa gỗ, bắt màu xanh của thuốc nhuộm xanh methylen. Các tế bào rất khác nhau về hình dạng, cấu tạo và tính chất. Khi trưởng thành, nội chất tiêu biến, gồm những tế bào chết. Các tế bào tập trung thành từng đám mô cứng xếp gần như liên tục tạo thành một vòng, đảm nhiệm chức năng cơ học. Phần gô (6) gồm 8-9 lớp tế bào chết, bắt màu xanh của thuốc nhuộm xanh methylen, có kích thước khác nhau, nằm phía trong libe tạo nên bó xếp chồng. Phần libe (7) gồm các tế bào sống, bắt màu hồng của thuốc nhuộm cacmin, có hình đa giác, nhỏ, xếp xít nhau tạo thành một vòng liên tục.
Lớp mô mềm (8) gồm các tế bào tròn cạnh, càng đi vào phần giữa tế bào càng lớn hơn. Lớp mô dày (9) gồm các tế bào sống có vách hóa dày không đều, hình tròn hoặc hình trứng, tế bào dài ra khi cây phát triển. Mô dày có chức năng nâng đỡ. Tinh thể Canxi oxalate (10) được hình thành trong tế bào mô mềm, tinh thể thường lấp đầy toàn bộ tế bào, thậm chí còn làm biến dạng tế bào. Tinh thể bắt màu xanh của thuốc nhuộm xanh metylen.
Hình 3.3. Giải phẫu cắt ngang lá cây A.bockiana
1. Biểu bì trên; 2. Mô giậu; 3. Mô xốp; 4. Biểu bì dưới; 5. Vòng mô cứng; 6. Gỗ;
7. Libe; 8. Mô mềm; 9. Mô dày; 10. Tinh thể canxi oxalat ( Hình ảnh quan sát ở độ phóng đại 160 lần)
So sánh đặc điểm giải phẫu lá và thân của loài A. bockiana trong nghiên cứu này với các loài A. glischroloma, A. lienii đã công bố cho thấy đặc điểm giải phẫu của các loài thuộc chi Adinandra có sự tương đồng.
3.2. Hoạt tính sinh học của cao chiết từ loài Adinandra bockiana
Loài A. bockiana được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 50°C đến khối lượng không đổi, sau đó đem nghiền nhỏ. Cao chiết phân đoạn của loài A. bockiana được điều chế theo sơ đồ hình 2.1 ở phần phương pháp đem sấy khô và sử dụng để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ loài A. bockiana
Cao chiết ethanol (M1, M2, M3), cao ethyl acetate (M4, M5, M6) và cao dichloromethane (M7, M8, M9) từ loài A. bockiana được sử dụng để thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn ở 3 nồng độ tương ứng là 20; 60 và 200 µg/ml. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ loài A. bockiana
V i Đường kính vòng kháng khuẩn (D - M 1 M2 M3 M4 5M M6 M7 M8 M9 B. su bti 6, 7 0 7 7, 15,7 7, 11,0 2,2 9,3 13, 24,0 , 0, 0, 0, ,0 ± 0, 0, 0, 0, S. 0 7, 13 5 6, 14 8, 11 14
G
hi c h ú :
- DMSO và H2O là đối chứng.
- M1, M2, M3: Cao ethanol lần lượt ở các nồng độ 20; 60 và 200 µg/ml. - M4, M5, M6: Cao ethyl acetate lần lượt ở các nồng độ 20; 60 và 200 µg/ml. - M7, M8, M9: Cao dichloromethane lần lượt ở các nồng độ 20; 60 và 200 µg/ml. Cao ethanol, cao ethyl acetate và cao dichloromethane đều thể hiện được hoạt
tính kháng vi khuẩn B. subtilis ở cả 3 nồng độ. Hoạt tính kháng vi khuẩn B. subtilis tăng dần từ nồng độ 20 µg/ml, tiếp theo là nồng độ 60 µg/ml và mạnh nhất là nồng độ 200 µg/ml. Đường kính vòng kháng khuẩn dao động khoảng từ 6,7-24 mm Trong đó, cao chiết dichloromethane ở nồng độ 200 µg/ml có hoạt tính kháng B. subtilis cao nhất, đường kính vòng kháng khuẩn đạt khoảng 24 mm (Hình 3.4).
Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết đối với vi khuẩn B. subtilis
Với vi khuẩn L. plantarum, cả ba loại cao chiết đều có hoạt tính kháng khuẩn ở
các nồng độ khảo sát. Đường kính vòng kháng khuẩn thu được nằm trong khoảng từ
3- 21,3 mm. Hoạt tính kháng vi khuẩn L. plantarum thấp nhất ở nồng độ 20 µg/ml, tiếp theo là nồng độ 60 µg/ml và cao nhất là nồng độ 200 µg/ml. Trong đó, cao dichloromethane có hoạt tính kháng vi khuẩn L. plantarum mạnh hơn so với cao ethanol và cao ethyl acetate. Ở nồng độ 200 µg/ml đường kính vòng kháng vi khuẩn L. plantarum từ cao dichloromethane đạt khoảng 21,3 mm (Hình 3.5).
Đối với vi khuẩn E. coli, các cao chiết ở nồng độ 20 µg/ml không có hoạt tính kháng khuẩn. Hoạt tính kháng vi khuẩn E. coli có được khi cao chiết ở nồng độ 60 µg/ml đối với cao ethyl acetate và nồng độ 200 µg/ml đối với cao ethanol và dichloromethane. Tuy nhiên, hoạt tính có được của các loại chiết đối với vi khuẩn
E. coli là yếu, đường kính vòng kháng khuẩn chỉ đạt khoảng 4,3-10,3 mm của cao chiết ethyl acetate (Hình 3.6).
Hình 3.6. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn E.coli
Đối với vi khuẩn S. marcescens, các cao chiết ở các nồng độ khảo sát đều có hoạt tính kháng khuẩn, ngoại trừ cao ethanol nồng độ 20 µg/ml không có hoạt tính kháng khuẩn. Tuy nhiên, hoạt tính kháng vi khuẩn S. marcescens có được của cao ethanol ở nồng độ 60; 200 µg/ml; cao ethyl acetate và cao dichloromethane ở nồng độ 20; 60; 200 µg/ml chỉ đạt ở mức thấp hoặc trung bình. Đường kính vòng kháng khuẩn có được dao động trong khoảng từ 5-14,3 mm (Hình 3.7).
Hình 3.7. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S. marcescens
Đối với vi khuẩn S. lutea, cả ba loại cao chiết đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn khá mạnh ở các nồng độ 20; 60; 200 µg/ml và cao hơn so với các loại vi khuẩn được khảo sát. Đường kính vòng kháng khuẩn dao động trong khoảng từ 16-29,7 mm. Hoạt tính kháng vi khuẩn S. lutea mạnh nhất đối với cao ethyl acetate ở nồng độ 200 µg/ml, tiếp đến là cao dichloromethane và ethanol (Hình
Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây A. bockiana với 5 loài vi khuẩn kiểm định cho thấy: (1) cao chiết ethanol có khả năng ức chế 4 loài vi khuẩn B. subtilis, S. marcessens, S. lutea, L. plantarum. (2) Cao chiết ethyl acetae và dichloromethane có khả năng ức chế cả 5 loài vi khuẩn B. subtilis, S. marcessens, S. lutea, L. plantarum, E. coli. (3) Cao chiết dichloromethane và ethyl acetae có khả năng ức chế tốt hơn cao chiết ethanol. Như vậy, hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bằng ethyl acetae và dichloromethane tốt hơn so với cao chiết bằng ethanol.
Hình 3.8. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S. lutea
So sánh với hoạt tính kháng khuẩn của loài Adinandra lienii thuộc cùng chi
Adinandra đã được tác giả Nguyễn Hữu Quân và cộng sự công bố, ta thấy 3 cao chiết ethyl acetate từ loài A. bockiana có hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn cao chiết từ ethyl acetate của loài A. lienii. Vì vậy, đối với loài A. bockiana có thể sử dụng 2 loài cao chiết từ dung môi ethyl acetate và dichloromethane để tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học.
3.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết loài A.bockiana
Hiện nay, hoạt tính chống oxy hóa từ các chất có nguồn gốc sinh học được các nhà khoa học quan tâm nhiều hơn. Các chất chống oxy hóa được biết đến như vitamin E, vitamin C, lycopen, resveratrol, và một số chất trao đổi thứ cấp khác trong cây. Các chất này được bổ sung vào dược phẩm và thực phẩm chức năng có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể, phòng và điều trị các bệnh do gốc tự do sinh ra như tiểu đường, tim mạch, alzheimer, ung thư…. Các chất chống
Trong nghiên cứu này, cao chiết ethyl acetate, cao dichloromethane và cao ethanol từ loài A. bockinana được chúng tôi thử nghiệm hoạt tính khử gốc tự do DPPH. Kết quả bảng 3.2 cho thấy, hiệu quả khử gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate, cao dichloromethane và cao ethanol tỉ lệ thuận với nồng độ cao chiết, khi nồng độ cao chiết tăng từ 0,5-128 µg/ml thì hiệu quả khử gốc tự do cũng tăng dần từ 0-89,8%. Cao ethyl acetate có hoạt tính mạnh nhất thể hiện ở nồng độ khử gốc tự do DPPH với giá trị EC50 là 0,2 µg/ml, tiếp đến là cao dichloromethane (giá trị EC50 là 0,47 µg/ml) và cao ethanol (giá trị đạt 5,7µg/ml). Tuy nhiên, ở nồng độ 128 µg/ml, thì hoạt tính khử gốc tự do của cao dichloromethane cao nhất đạt 89,8%; tiếp đến là cao ethyl acetate (đạt 84,1%) và cao ethanol (đạt 71,5%). Màu sắc của dung dịch khử gốc tự do DPPH trước khi đo đối với cao ethanol được minh họa ở hình 3.9.
Bảng 3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết Khả năng khử gốc tự do DPPH (%) N ồ n g C a o di C a o 83 0 84 1 87 70 87 77 84 71 E 0 µ 0 µ 5 7
M D 10 0 93 85 91 20 2 4 1 8 2 7 4 1 4 1 1 1 0 0. 8 6 , 3 , 0 6 IC 4 5 4
Hình 3.9. Màu sắc của mẫu khử gốc tự do DPPH trước khi đo của cao ethanol
3.2.3. Hoạt tính kháng tế bào ung thư của cao chiết ethanol từ loài A. bockiana
Gao et al (2010) đã phân lập được camellianin A, một loại flavonoid từ lá của loài Adinandra nitida và đã chứng minh được chất này có hoạt tính ức chế sự tăng sinh và quá trình apoptosis của tế bào ung thư gan (Hep G2) và ung thư tuyến vú (MCF-7)[14]. Một số hợp chất dị vòng chứa coumarin có liên quan đến các đặc tính như chống viêm (El-Haggar and Al-Wabli, 2015), kháng khuẩn (Shi and Zhou,
2011), kháng virus (Tsay et al., 2014) và chống ung thư (Jacquot et al., 2007). Ngoài ra, coumarin cũng thể hiện tác dụng gây độc tế bào ung thư đối với các tế bào Hep2 (loại biểu mô người), ảnh hưởng tới quá trình apoptosis, sự biến mất của lớp màng vi nhung mao, làm giảm hàm lượng huyết tương của tế bào chất và sự