Các kết quả nghiên cứu
3.3.1. Tính năng diệt khuẩn của sơn nano
Để khảo sát tính năng diệt khuẩn của sơn nano chúng tơi khảo sát sự diệt khuẩn của bề mặt sơn nano trong 2 mơi tr−ờng lμ mơi tr−ờng dung dịch nuơi cấy vμ mơi tr−ờng khơng khí trong phịng cĩ sơn nano. Trong việc nghiên cứu thử nghiệm chúng tơi đã nhận đ−ợc sự hợp tác giúp đỡ vμ t− vấn của các đồng nghiệp tại phịng thí nghiệm sơn diệt khuẩn của Viện Hμn lâm KH Vật liệu xây dựng Trung Quốc (CBMA) vμ Phịng thử nghiệm hoạt tính sinh học của Viện Hĩa hợp chất tự nhiên, Viện khoa học cơng nghệ Việt Nam. Ph−ơng pháp thử nghiệm đ−ợc tiến hμnh theo tiêu chuẩn HG/T3950-2007 của Trung Quốc về lớp phủ diệt khuẩn (antibacterial coating)
3.3.1.1. Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sơn nano trong mơi tr−ờng nuơi cấy vi
sinh vật
1) Mẫu sơn: Mẫu sơn nano đ−ợc quét lên tiêu bản bằng vữa xi măng-cát thμnh các tấm cĩ kích th−ớc 10 x20 cm. Để so sánh mức độ diệt khuẩn của các loại bột nano chúng tơi thử nghiệm trên 4 mẫu sơn:
- Sơn thơng th−ờng khơng cĩ nano (mẫu đối chứng) - Sơn cĩ chứa nano TiO2-VIBM do đề tμi chế tạo - Sơn cĩ chứa nano TiO2- P25 của Degussa (Đức) - Sơn cĩ chứa nano TiO2 – CBMA ( Trung Quốc) 2) Các chủng vi sinh vật kiểm tra bao gồm:
-Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922 )
- Nấm sợi: Aspergillus niger
3) Mơi tr−ờng nuơi cấy vi sinh vật:
Mơi tr−ờng czapek dịch thể cho nấm mốc, mơi tr−ờng thạch th−ờng cho vi khuẩn.
4) Ph−ơng pháp tiến hμnh:
Các b−ớc thử nghiệm đ−ợc tiến hμnh nh− trình bầy ở hình 20 sau:
Chuẩn bị vi khuẩn
Chuẩn bị vi khuẩn với các nồng độ pha lỗng khác nhau
Chuẩn bị mẫu đối chứng
Chuẩn bị mẫu vi khuẩn( nấm) trên sơn nano vμ các vật liệu so sánh
Đánh giá, tính tốn kết quả
Hình 20: Sơ đồ các b−ớc thử nghiệm tính diệt khuẩn của sơn nano
B−ớc1: Chuẩn bị vi sinh vật:
________________________________________________________________________________ 47
Nấm vμ vi khuẩn đ−ợc duy trì trong mơi tr−ờng dinh d−ỡng thích hợp. Các chủng kiểm định đ−ợc hoạt hố tr−ớc khi tiến hμnh thử nghiệm trong mơi tr−ờng dinh d−ỡng dịch thể đặc biệt (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm). Sau đĩ đ−ợc pha lỗng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland để tiến hμnh thí nghiệm (Nồng độ vi khuẩn khoảng 5x108 CFU/ml (đơn vị khuẩn lạc vi sinh vật/ml). Dùng dịch nμy lμm dịch vi khuẩn (nấm) cĩ nồng độ gốc: 100.
B−ớc 2: Pha lỗng dịch gốc: Pha lỗng dung dịch chứa vi khuẩn ở trên thμnh 06 nồng độ từ 10-1-10-8
- Nuơi cấy dịch gốc để xác định l−ợng VSV chuẩn cho thí nghiệm:
Nhỏ dung dịch cĩ nồng độ vi khuẩn 10-6 - 10-8 vμo từng hộp lồng, thêm mơi tr−ờng thạch thích hợp cho vi khuẩn ( nấm) đã khử trùng vμ tan chảy vμ ủ 24 h ở nhiệt độ 36- 370 C cho vi khuẩn vμ 48 h ở nhiệt độ 300C cho nấm. Sau khi ủ lấy mẫu ra đếm số l−ợng khuẩn lạc để tính kết quả số đơn vị khuẩn lạc vi sinh vật /1ml (CFU/ml)
B−ớc 3: Phun đều 0,5 ml vi sinh vật ( nấm ; vi khuẩn) đã chuẩn bị ở nồng độ 10-3
lên bề mặt mẫu các bề mặt sơn thử nghiệm đã nêu trên vμ mẫu đối chứng (bề mặt kính).
- Hoạt hố các bề mặt đã phủ VSV bằng ánh sáng th−ờng trong 30 phút
B−ớc 4: Đặt các tấm vật liệu đã đ−ợc phủ vi khuẩn ( nấm) vμo hộp vμ đem ủ ở nhiệt độ 370C, 24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ ở 300C đối với nấm. Duy trì ở độ ẩm 90%.
B−ớc 5: Rửa mẫu để phân lập lại vi khuẩn ( nấm ):
- Sau khi ủ, mẫu đ−ợc lấy ra, rửa cẩn thận các bề mặt đã phun vi sinh vật bằng 19,5 ml dung dịch n−ớc muối 9%.
B−ớc 6.
- Pha lỗng dịch vi khuẩn (nấm) của b−ớc 5 theo các thang nồng độ khác nhau.
Cho 0,1 ml dung dịch sau khi pha lỗng vμ mơi tr−ờng thạch thích hợp sau đĩ vi khuẩn đ−ợc ủ ở nhiệt độ 370C, 24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ ở 300C đối với nấm.
B−ớc 7: Tính tốn kết quả.
Kết quả số đơn vị khuẩn lạc vi sinh vật/ml ( CFU/ml)cịn lại trong mẫu.
Đếm số l−ợng khuẩn lạc trên các đĩa thạch nuơi cấy rồi tính theo cơng thức:
X = (a1+a2+ a3)/3. c/b
Trong đĩ: a1; a2; a3 – số khuẩn lạc đếm đ−ợc trên 3 hộp petri đ−ợc lặp lại ở cùng độ pha lỗng
b – số ml dịch pha lỗng nuơi cấy c - độ pha lỗng
L−u ý: chỉ đ−ợc đếm khuẩn lạc trên các đĩa nuơi cấy cĩ số khuẩn lạc khơng v−ợt quá 150 khuẩn lạc/ đĩa nuơi cấy.
Kết quả % sống sĩt của VSV của các vật liệu so với chứng, tính theo cơng thức:
A=100*B/C
Trong đĩ: - A: % VSV sống sĩt trên vật liệu
- B: Số l−ợng VSV cịn lại trên bề mặt vật liệu - C: Số VSV trên bề mặt đối chứng
5) Kết quả vμ nhận xét:
- Số l−ợng VSV của dịch gốc tr−ớc khi pha lỗng để lμm thí nghiệm lμ:
+ Vi khuẩn E. coli (CFU/ml) : 4,8ì109 + Nấm mốc A. niger (CFU/ml) : 6,5ì108
- Số l−ợng vi sinh vật nμy lμ phù hợp cho thí nghiệm theo lý thuyết. Vì vậy các thí nghiệm tiếp theo lμ đảm bảo độ tin cậy.
- Kết quả nuơi cấy:Kết quả về số l−ợng vi sinh vật cịn lại vμ khả năng sống sĩt của VSV trên các vật liệu sau khi thử nghiệm đ−ợc trình bầy tại bảng 10 vμ hình 21.
Bảng10: Số VSV sống sĩt sau thử nghiệm hoạt hố quang hĩa bằng ánh sáng th−ờng trên các mẫu sơn nano
Vi khuẩn E. coli Nấm mốc A. niger
VSV
Mẫu TN (CFU/ml) % sống sĩt (CFU/ml) % sống sĩt
Đối chứng (bề mặt kính) 1,2ì109 100 1,5ì108 100 Bề mặt mẫu Sơn th−ờng
1,4ì105 1,16ì10-2 560 3,7ì10-4 Bề mặt sơn mẫu nano
TiO2-VIBM 40 3,3ì10-6 160 1,06ì10-4 Bề mặt mẫu sơn nano
P-25 Degussa 0 0 0 0
Bề mặt mẫu sơn nano
CBMA China 40 3,3ì10-6 0 0
Vi khuẩn E. coli
Mẫu đối chứng Sơn th−ờng Sơn nano TiO2 Degussa P25
Sơn nano TiO2 CBMA
Sơn nano TiO2 VIBM
Nấm mốc A. niger
Mẫu đối chứng Sơn th−ờng TiO2 Degussa P25 TiO2 CBMA TiO2 VIBM
Hình 21: Các mẫu vi khuẩn vμ nấm mốc sau khi thử nghiệm với bề mặt của sơn nano
Tính năng diệt khuẩn vμ diệt nấm mốc đ−ợc đánh giá trên cơ sở số l−ợng vi khuẩn hoặc nấm mốc cịn sống trong mơi tr−ờng nuơi cấy cĩ tiếp xúc với bề mặt của sơn nano so sánh với mẫu đối chứng. Từ các kết quả thực nghiệm thu đ−ợc chúng tơi cĩ các nhận xét nh− sau:
- Nếu so với bề mặt kính khơng cĩ sơn lμm đối chứng thì cả 4 bề mặt sơn nano TiO2: Deggusa; CBMA; VIBM vμ sơn th−ờng đều cĩ khả năng diệt nấm vμ
khuẩn ở các mức độ khác nhau.
- So với mẫu sơn th−ờng thì cả 3 mẫu sơn nano cịn lại đều cĩ khả năng diệt VSV khác biệt, cao hơn hẳn. Trong đĩ mẫu sơn nano P-25 Degussa cĩ khả năng diệt nấm vμ vi khuẩn tốt nhất, ở ngay nồng độ đầu tiên sau khi ủ, vật liệu nμy đã diệt hoμn toμn nấm vμ vi khuẩn; tiếp theo lμ mẫu sơn nano CBMA cĩ khả năng diệt nấm hoμn toμn ở nồng độ thử ban đầu, vi khuẩn chỉ cịn 40CFU/ml; tiếp theo nữa lμ mẫu sơn nano TiO2-VIBM, diệt nấm cũng khá tốt, số đơn vị khuẩn lạc cịn sĩt lại lμ 40CFU/ml với E.coli vμ 160CFU/ml với A. Niger.
3.3.1.2. Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sơn nano trong mơi tr−ờng khơng khí
Hình 22: Sơ đồ vị trí đặt các mẫu thí nghiệm diệt khuẩn trong mơi tr−ờng khơng
6 2 1 3 4 13 Phịng bên trong 9 10 5 7 Cửa ra Phịng ngoμi μ 12 11 8
________________________________________________________________________________ 51
Chúng tơi đã tiến hμnh thử nghiệm tính năng diệt khuẩn của sơn nano xúc tác quang hĩa trong mơi tr−ờng khơng khí. Các thí nghiệm đ−ợc thực hiện tại một phịng nuơi cấy vi sinh vật của Viện Hĩa hợp chất Tự nhiên Viện KHCN Việt Nam.
Sơn cĩ chứa nano TiO2-VIBM theo cấp phối M5 (sơn t−ờng trong) đ−ợc quét lên t−ờng của 2 căn phịng mỗi phịng rộng 40m2 (Kích th−ớc Rộng 5m, dμi 8 m, cao 3 m) với mục đích tạo nên khơng khí trong khơng gian của căn phịng luơn tiếp xúc với mμng sơn nano trên t−ờng.
Thí nghiệm về tính năng diệt khuẩn trong mơi tr−ờng khơng khí đ−ợc đánh giá bằng sự nhiễm khuẩn hoặc nhiễm vi sinh vật trong khơng khí của khơng gian nμy vμ đ−ợc thực hiện bằng cách để các đĩa nuơi cấy trong các vị trí trong căn phịng theo sơ đồ hình 22. Sau đĩ kiểm tra mức độ nhiễm khuẩn hoặc nấm mốc của các mẫu thí nghiệm (đĩa petri) đặt tại các vị trí nμy. Việc thí nghiệm đ−ợc thực hiện theo 3 thời điểm:
- Sự nhiễm vi sinh vật trong khơng khí tr−ớc khi sơn (mẫu đối chứng) - Sự nhiễm vi sinh vật trong khơng khí trong phịng sau khi sơn 18 giờ. - Sự nhiễm vi sinh vật trong khơng khí sau 96 giờ (sau 4 ngμy)
Chuẩn bị mơi tr−ờng: 3 loại mơi tr−ờng thạch vơ trùng, lμ những mơi tr−ờng dùng để nuơi cấy cho hầu hết các loại vi sinh vật thơng th−ờng trong khơng khí: Thạch th−ờng (TT), Czapek (Cz), Hanxen (Hx). Mỗi loại mơi tr−ờng đ−ợc cho ra 5 đĩa petri (đ−ờng kính 10cm) với một lần thí nghiệm.
Tiến hμnh thí nghiệm: Đặt các đĩa petri chứa mơi truờng vμo các vị trí đã xác định theo sơ dồ của hình 22 vμ đ−ợc ký hiệu theo bảng 11.
Tính tốn kết quả: Tác dụng diệt khuẩn đ−ợc đánh giá bằng mức độ diệt khuẩn trên mỗi loại mơi tr−ờng ở các vị trí khác nhau theo cơng thức:
R=100 x (B-A)/B
Trong đĩ :
- R: Mức độ diệt khuẩn (%)
- B: Số l−ợng vi sinh vật trong mẫu đối chứng (tr−ớc khi sơn)
Theo kết quả ở các bảng trên với khuẩn lạc đ−ợc nuơi cấy trong 3 mơi tr−ờng thì sau khi sơn 18 giờ mμng sơn đã phát huy tác dụng diệt khuẩn với kết quả giảm l−ợng vi khuẩn trong khơng khí từ 24% đến 81% (so với tr−ớc khi sơn) tùy thuộc vμo các vị trí đạt mẫu thí nghiệm trong phịng. Sau 4 ngμy mức độ diệt khuẩn cĩ giảm ở mức từ 10% đến 76 %. Các kết quả nμy khẳng định sơn nano TiO2 cĩ tác dụng diệt khuẩn, diệt nấm mốc trong mơi tr−ờng khơng khí trong khơng gian cĩ tiếp xúc với mμng sơn.
Bảng 11: Ký hiệu các đĩa Petri chứa mơi tr−ờng
1- TT1 4- TT4 7- Cz3 10- Hx2 13- TT5
2- TT2 5- Cz1 8- Cz4 11- Hx3 13- Cz5
3- TT3 6- Cz2 9- Hx1 12- Hx4 13- Hx5
Mở nắp các đĩa petri vμ để khoảng 15 phút để các vi sinh vật trong phịng rơi vμo, sau đĩ đậy lại vμ ủ ở 300C. Sau khoảng 48-72 giờ thì lấy ra vμ đếm số khuẩn lạc mọc trên các đĩa chứa mơi tr−ờng. Kết quả đ−ợc trình bầy tại các bảng 12, 13, 14 vμ các hình 22, 23, 24 d−ới đây.
Bảng 12: Kết quả thí nghiệm tính năng diệt khuẩn trong khơng khí – Thí nghiệm nuơi cấy trong mơi tr−ờng thạch (Agar)
Số l−ợng khuẩn lạc mọc trên mơi tr−ờng thạch th−ờng Sau khi sơn 18 giờ Sau khi sơn 96 giờ STT Kí hiệu đĩa mẫu Tr−ớc khi sơn Số l−ợng R (%) Số l−ợng R (%) 1 TT1 100 76 24,00 90 10 2 TT2 120 76 36,67 89 25,83 3 TT3 96 52 45,83 55 42,71 4 TT4 132 60 54,55 31 76,52 5 TT5 100 19 81,00 38 62
________________________________________________________________________________ 53
Bảng 13: Kết quả thí nghiệm tính năng diệt khuẩn trong khơng khí – Thí nghiệm nuơi cấy trong mơi tr−ờng Hanxen
Số l−ợng khuẩn lạc mọc trên mơi tr−ờng Hanxen STT Kí hiệu đĩa mẫu Tr−ớc khi sơn Sau khi sơn 18 giờ
R (%) Sau khi sơn 96 giờ R (%) 1 Hx1 82 69 15,85 72 12,20 2 Hx2 39 26 33,33 30 23,08 3 Hx3 40 26 35,00 15 62,50 4 Hx4 49 19 61,22 29 40,82 5 Hx5 60 16 73,33 39 35,00
Bảng 14: Kết quả thí nghiệm tính năng diệt khuẩn trong khơng khí – Thí nghiệm nuơi cấy trong mơi tr−ờng Czapek
Số l−ợng khuẩn lạc mọc trên mơi tr−ờng Czapek STT Kí hiệu đĩa mẫu Tr−ớc khi sơn Sau khi sơn 18 giờ
R (%) Sau khi sơn 96 giờ R (%) 1 Cz1 25 20 20,00 10 60,00 2 Cz2 11 8 27,27 8 27,27 3 Cz3 6 5 16,67 5 16,67 4 Cz4 38 27 28,95 10 73,68 5 Cz5 8 6 25,00 5 37,50
Hình 22: Sự phát triển của vi khuẩn lạc tr−ớc khi sơn