Cellulose trong thành tế bào thực vật chiếm khoảng 32-56% tổng trọng lượng tế bào, tuy nhiên trong thành phần tế bào thực vật còn có hemicellulose, lignin và các chất khác. Thành phần hóa học của một vài loại vật liệu có chứa cellulose được nêu ở bảng 1.2.
Bảng 1.2. Thành phần hóa học của một vài loại vật liệu có chứa cellulose
Nguồn Thành phần polymer trong các loại vật liệu có chứa cellulose( %)
Cellulose Hemicellulose Lignin Dịch chiết
Gỗ cứng 43-47 25-35 16-24 2-8 Gỗ mềm 40-44 25-29 25-31 1-5 Bã mía 40 30 20 10 Xơ dừa 32-43 10-20 43-49 4 Bắp ngô 45 35 15 5 Thân ngô 35 25 35 5
Dựa vào bảng 1.2 ta có thể thấy bã mía chưa tới 40% là cellulose, ngoài ra, bã mía là vật liệu dễ kiếm, giá thành rẻ, nên trong phạm vi nghiên cứu này, tôi sử dụng bã mía là nguyên liệu để tách cellulose.
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và dụng cụ 2.1.1. Hóa chất - Trấu - Chitosan thành phẩm (độ deacetyl > 90%) - Enzyme cellulase - Nước cất
- Axit clohydric – HCl (độ tinh khiết 36%)
- Kali hidroxit – KOH
- Axit photphoric H3PO4
2.1.2. Dụng cụ
- Coomassive Brillant Blue
- Etanol C2H5OH
- Axit axetic – CH3COOH (độ tinh
khiết 99,5%)
- Sodium tripoplyphosphat–
Na5P3O10
- Natri dihydrophotphat – NaH2PO4
- Bã mía
- Sodium tripolyphosphat – Na5P3O10
Bảng 2.1. Các dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ và thiết bị Số lượng Dụng cụ và thiết bị Số lượng
Bình tam giác 250ml 2 Giấy quỳ 3
Cốc đong 500ml 2 Giấy lọc Whatman 1 hộp
Cốc đong 250ml 2 Con khuấy từ 3
Cốc đong 100ml 3 Ống sừng bò 1
Ống đong 100ml 2 Ống đựng mẫu 50
Ống đong 50ml 2 Bình chiết 2
Ống đong 25ml 2 Giấy bạc 1 cuộn
Đũa thủy tinh 3 Nồi nhôm 2
Nhiệt kế 100oC 1 Cân điện tử 1
Nhiệt kế 200oC 1 Giá đỡ 4
B1: Rửa sạch , sấy khô
B2: Xử lý bằng axit B3: Rửa sạch đến
pH=7, sấy khô Trấu thô
Nung
Nung trong khoảng 650-700oC trong 8-12h Rửa trung hòa
Loại tạp chất
2.2. Quy trình tách silic từ vỏ trấu
2.2.1. Phương pháp chuyển vỏ trấu thành tro trấu
Trấu sẽ được rửa sạch loại bỏ bụi bẩn và tạp chất, sau đó sấy khô ở nhiệt độ
1050C trong 5h, sau đó sẽ được xử lý bằng axit HCl (1M) trong khoảng 1h, rửa sạch
lại bằng nước cất đến khi đạt pH = 7, sau đó đem sấy khô ở 1050C trong 5h.
Ta đem trấu cho vào lò nung, nung ở nhiệt độ 650-7000C trong khoảng 8h-
12h, ta sẽ thu được SiO2 (80-90%). Sau đây là sơ đồ chuyển hóa trấu thành tro trấu.
Tro trấu
a b
Hình 2.2. Vỏ trấu (a), Trấu sau nung (b)
2.2.2. Chiết silica từ tro trấu
Silica từ tro trấu (RHA) được chiết bằng cách khuấy với dung dịch KOH 4% ở tỷ lệ khối lượng 1:10 (g/ml- RHA: dung dịch KOH) sau đó gia nhiệt đến nhiệt độ sôi của hỗn hợp trong 1h. Hỗn hợp được để qua đêm, lọc, rửa 2 lần với nước cất với tỷ lệ 1:8 (hỗn hợp: nước). Thêm HCl 10% vào hỗn hợp nước lọc, điều chỉnh pH đạt 5-7 để tạo kết tủa silica gel. Đem mẫu silica gel hút chân không và sấy đuổi nước ở
105 oC, nghiền nhỏ để thu được silica dạng hạt mịn.
.
Hình 2.3. Mẫu SiO2 dạng bột
2.3. Quy trình tạo hạt CTS/SiO2
Hòa tan 0,5g chitosan trong 100ml dung dịch axit axetic 1%, thêm 0,1g SiO2
vào dung dịch chitosan, khuấy nhẹ 30 phút cho hỗn hợp phân tán đều.
Hỗn hợp sau khi đồng nhất được bổ sung nhỏ giọt 2ml dung dịch STPP nồng độ 2mg/ml ở trên trong 20 phút, giữ hệ trong điều kiện khuấy 600 v/p ở nhiệt độ
phòng trong 1h. Sau quá trình tẩm, hạt CTS/SiO2 được lọc hút trong điều kiện chân
2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt CTS/SiO2
2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ CTS/ SiO2
Hòa tan lần lượt 1g; 1,5g; 2g; 2,5g; 3g chitosan trong 250ml dung dịch axit
axetic 1%, thêm 2g SiO2 vào dung dịch chitosan, khuấy nhẹ 30 phút cho hỗn hợp
phân tán đều.
Hỗn hợp sau khi đồng nhất được bổ sung nhỏ giọt 5ml dung dịch STPP nồng độ 2mg/ml trong 20 phút, giữ hệ trong điều kiện khuấy 600v/p ở nhiệt độ phòng
trong 1h. Sau quá trình tẩm, hạt CTS/SiO2 được lọc hút trong điều kiện chân không.
Kí hiệu mẫu: HL1; HL1,5; HL2; HL2,5; HL3.
2.4.2. Khảo sát ảnh hưởng thời gian nhỏ giọt STPP
Hòa tan 1,5g chitosan trong 250ml dung dịch axit axetic 1%, thêm 2g SiO2
vào dung dịch chitosan, khuấy nhẹ 30 phút cho hỗn hợp phân tán đều.
Hỗn hợp sau khi đồng nhất được bổ sung nhỏ giọt 5ml dung dịch STPP nồng độ 2mg/ml ở các thời gian khác nhau: 10 phút; 20 phút; 30 phút; 40 phút; 50 phút giữ hệ trong điều kiện khuấy 600v/p ở nhiệt độ phòng trong 1h. Sau quá trình tẩm,
hạt CTS/SiO2 được lọc hút trong điều kiện chân không. Kí hiệu mẫu: T10; T20;
T30; T40; T50.
2.4.3. Khảo sát ảnh hưởng tốc độ khuấy
Hòa tan 1,5 (g) chitosan trong 250ml dung dịch axit axetic 1%, thêm 2g SiO2
vào dung dịch chitosan, khuấy nhẹ 30 phút cho hỗn hợp phân tán đều.
Hỗn hợp sau khi đồng nhất được bổ sung nhỏ giọt 5ml dung dịch STPP nồng độ 2mg/ml trong 20 phút, giữ hệ trong điều kiện khuấy lần lượt là: 200v/p; 400v/p; 600v/p; 800v/p; 1000v/p ở nhiệt độ phòng trong 1h. Sau quá trình tẩm, hạt
CTS/SiO2 được lọc hút trong điều kiện chân không. Kí hiệu mẫu: V2; V4; V6; V8;
V10.
2.5. Quy trình cố định enzyme lên CTS/SiO2
2.5.1. Quy trình chung
Pha enzyme trong nước cất để đạt nồng độ 5mg/ml, sau đó cho 10mg hạt
CTS/SiO2 vào dung dịch enzyme cellulase. Hỗn hợp được khuấy và ủ trong 24h ở
40C. Sau thời gian ủ, lọc để thu hạt E-CTS/SiO2, sau đó hạt được rửa 2-3 lần với
dung dịch đệm phosphat để loại enzyme tự do. Cách pha dung dịch đệm phosphat:
- Pha dung dịch NaH2PO4 0,2M: Hòa tan 11,9g NaH2PO4 trong 500ml nước
- Pha dung dịch Na2HPO4 0,2M: Hòa tan 14,19g Na2HPO4 trong 500ml nước cất (dung dịch b);
- Pha dung dịch đệm phosphat pH=7: Lấy 39ml dung dịch a + 61 ml dung dịch b + 100 ml nước cất.
Hình 2.4. Quá trình cố định enzyme cellulase lên chất mang CTS/SiO2
2.5.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình cố định enzyme lên CTS/SiO2
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khuấy ủ
Hòa tan 150ml enzyme với nồng độ 5mg/ml, sau đó cho 10mg hạt CTS/SiO2
vào dung dịch enzyme cellulase. Hỗn hợp được khuấy và ủ ở những thời gian khác
nhau: 6h; 12h, 18h; 24h ở 40C. Sau thời gian ủ, lọc để thu hạt E-CTS/SiO2, sau đó
hạt được rửa 2-3 lần với dung dịch đệm phosphat để loại enzyme tự do. Kí hiệu mẫu: U1-6h; U2-12h; U3-18h; U4-24h.
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Pha 150ml enzyme cellulase với nồng độ lần lượt là: 1mg/l; 3mg/l; 5mg/l;
7mg/l, sau đó cho 10mg hạt CTS/SiO2 vào dung dịch enzyme cellulase. Hỗn hợp
được khuấy và ủ trong 24h ở 40C. Sau thời gian ủ, lọc để thu hạt E-CTS/SiO2,
sau đó hạt được rửa 2-3 lần với dung dịch đệm phosphat để loại enzyme tự do. Kí hiệu mẫu: M1-1mg/ml; M3-3mg/ml; M5-5mg/ml; M7-7mg/ml.
2.6. Quy trình thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase
2.6.1. Quy trình khảo sát nồng độ cellulose tới quá trình thủy phân bằngenzyme cellulase tự do enzyme cellulase tự do
Hòa tan 2g enzyme cellulase trong 50ml nước cất, sau đó cho lần lượt lượng cellulose 1g, 2g, 3g, 4g, 5g vào trong dung dịch enzyme cellulase. Thực hiện phản
tiến hành lọc hút chân không thu lại và cân bã cellulose để xác định hiệu suất phản ứng thủy phân.
Hình 2.5. Thực hiện quá trình thủy phân cellulose
2.6.2. Quy trình thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase cố định
Cho 4g enzyme cellulase đã được cố định trên chất mang CTS/SiO2 vào 50ml
nước cất, sau đó cho 0,5g cellulose vào dung dịch chứa enzyme cố định. Thực hiện
phản ứng thủy phân ở 500C trong thời gian 24h. Kết thúc phản ứng thủy phân tiến
hành lọc hút chân không, cân lượng rắn còn lại và tính hiệu suất phản ứng thủy phân.
2.7. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford
Để xác định hàm lượng protein trên enzyme ta sử dụng thuốc thử Bradford. Trong các phương pháp xác định hàm lượng protein thì đây là phương pháp dễ thực hiện, hóa chất đơn giản và tốn ít thời gian.
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự thay đổi bước sóng cực đại của dung dịch chất nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức với protein. Trong dung dịch axit, khi chưa kết nối với protein thì dung dịch có màu nâu nhạt, sau khi kết hợp với protein thì dung dịch chuyển sang màu xanh và có bước sóng hấp thu cực đại ở 595nm. Để xác định hàm lượng protein trong mẫu, trước tiên ta phải xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết nồng độ. Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo dung dịch này bằng máy quang phổ kế (Spetrophotometer) ta được độ hấp thu sẽ tỷ lệ với lượng protein trong mẫu. Lượng protein trong mẫu đo được xác định thông qua đường chuẩn albumine đã dựng được từ giá trị độ hấp thụ trên trục tung, từ đó suy ra nồng độ protein trên trục hoành.
a
b
2.7.1. Phương pháp xác định đường chuẩn
Hóa chất:
Dung dịch Albumine 0,1%
Dung dịch thuốc thử Bradford: thành phần thuốc thử trong 1000ml như sau:
- Coomassie Brilliant Blue: 0,1g - Etanol 95%: 50ml
- H3PO4 85%: 100ml
- Nước cất: 850ml
Dựng đường chuẩn albumine:
Pha loãng dung dịch albumine thành các nồng độ khác nhau: 100 µg/ml, 50 µg/ml, 25 µg/ml, 20 µg/ml, 10 µg/ml. Mỗi mẫu albumine lấy 1ml cho vào lần lượt các ống nghiệm cùng với 2ml dung dịch Bradford.
Bảng 2.2. Dựng đường chuẩn albumine
Ống nghiệm 1 2 3 4 5
Dung dịch Albumine (µg/ml) 100 50 25 20 10
Thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2
Tất cả các ống nghiệm sau khi pha đúng nồng độ, để khoảng 30 phút, tiến hành đo mật độ quang của dung dịch ở bước sóng 595 nm, độ hấp thu của dung dịch albumine chuẩn ở bước sóng 595 nm, từ đó có thể vẽ được đường chuẩn albumine.
Hình 2.4. Dung dịch thuốc thử Bradford (a); Dung dịch thuốc thử Bradford ở các nồng độ albumine khác nhau (b)
Hình 2.5. Đồ thị đường chuẩn dung dịch albumine
2.7.2. Phương pháp đánh giá xác định hàm lượng enzyme trên hạt CTS/SiO2
Lấy 0,2g enzyme cellulase đã được phủ lên hạt CTS/SiO2 cho vào các ống
nghiệm chứa 2ml dung dịch Bradford, sau đó lắc đều, để khoảng 30 phút. Đem mẫu đi đo ở mật độ quang ở bước sóng 595nm.
Hình 2.7. Mẫu E-CTS/SiO2 khi cho dung dịch Bradford ở lượng enzyme khác nhau
2.8. Các phương pháp đặc trưng cấu trúc
2.8.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR)
Khi chiếu một chùm bức xạ điện tử vào một môi trường vật chất, sẽ xảy ra hiện tượng các phân tử vật chất hấp thu hay phát xạ năng lượng [4]. Hiệu số năng lượng mà phân tử hấp thu hay phát xạ có giá trị là:
∆ E = E2 – E1 = h
Trong đó: E1, E2 là mức năng lượng phân tử ở trạng thái đầu và cuối H là hằng số Planck
là tần số của bức xạ điện từ
Khi phân tử hấp thu năng lượng của bức xạ điện từ sẽ gây ra những thay đổi trong cấu tạo phân tử như: làm quay hay dao động các nguyên tử trong phân tử hoặc làm biến dạng các đám mây điện tử trong phân tử, được thể hiện trên phổ IR
là dao động hoá trị và dao động biến dạng.
Hình 2.8. Dao dộng hóa trị và dao động biến dạng
Như vậy, bằng thực nghiệm có thể xác định các bước sóng của bức xạ hồng ngoại tương ứng với các liên kết giữa các nguyên tử. Tại bước sóng đó, liên kết hấp thu năng lượng bức xạ để chuyển sang một mức dao động mới, mức dao động ở trạng thái kích thích và bước sóng đó đặc trưng cho liên kết tương ứng. Do có độ nhạy cao, nên phổ FT-IR được sử dụng trong phân tích cấu trúc, phát hiện nhóm – OH trên bề mặt, phân biệt các tâm axit Lewis và các tâm Bronsted.
Mật độ các tâm axit Lewis và các tâm Bronsted thu được từ định luật Lambert–Beer. Sự hấp phụ A1 được xác định bởi diện tích hợp thành dưới đường cong theo biểu thức :
A1 = BC ∫ evdv
Trong đó : ∫ 𝑒𝑣𝑑𝑣 là hệ số dập tắt và nó được proton hóa tới iv= 0,4343 cm
µmol-1
B liên quan đến tỉ lệ xốp theo trọng lượng (g)/diện tích (cm-2)
C là mật độ của các tâm axit.
Do vậy mật độ các tâm axit và các tâm Bronsted được xác định theo biểu thức:
A1 (1545cm−1) CBronsted = w(0,4343 × 3,26)cm−2 A1 (1450cm−1) CLewis = w(0,4343 × 3,26)cm−2
Trong đó Iv = 3,03 cm �mol-1 hoặc 3,26 cm �mol-1 cho các dải tương ứng tại
1545 và 1450 cm-1.
Mẫu thí nghiệm được đo tại khoa Hóa thuộc Đại học Khoa học Tự nhiên và phòng thí nghiệm Lọc- Hóa dầu thuộc Đại học Mỏ- Địa chất
2.8.2. Phương pháp kính hiển vi điện tử quét (SEM)
SEM là một công nghệ mạnh mẽ để nghiên cứu hình thái bề mặt sử dụng chùm electron để quét qua bề mặt của mẫu. Hiện nay, kính hiển vi điện tử quét đã
được sử dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu hình thái bề mặt mẫu, nhất là với nghiên cứu mẫu màng mỏng.
Một chùm tia điện tử đi qua các thấu kính điện từ tiêu tụ thành một điểm rất nhỏ chiếu lên bề mặt mẫu nghiên cứu, Khi các điện tử của chùm tia tới va chạm với các nguyên tử ở bề mặt vật rắn thì có nhiều hiệu ứng xảy ra. Từ điểm ở bề mặt mẫu mà chùm điện tử chiếu đến, có nhiều loại hạt, loại tia được phát ra gọi chung là các loại tín hiệu. Mỗi loại tín hiệu phản ánh một đặc điểm của mẫu tại thời điểm được điện tử chiếu đến (số lượng điện tử thứ cấp phát ra phụ thuộc độ lồi lõm ở bề mặt mẫu, số điện tử tán xạ ngược phát ra phụ thuộc nguyên tử số Z, bước sóng tia X phát ra phụ thuộc nguyên tử ở mẫu là nguyên tố nào…). Cho chùm điện tử quét lên mẫu, và quét một cách đồng bộ một tia điện tử trên một màn hình. Thu và khuếch đại một loại tín hiệu nào đó từ mẫu phát ra để làm thay đổi cường độ sáng của tia điện tử quét trên màn hình, ta thu được ảnh. Nếu thu tín hiệu ở mẫu là điện tử thứ cấp ta có kiểu ảnh điện tử thứ cấp, độ sáng tối trên ảnh cho biết độ lồi lõm trên bề mặt mẫu. Với các mẫu dẫn điện, chúng ta có thể thu trực tiếp điện tử thứ cấp của mẫu phát ra, còn với các mẫu không dẫn điện chúng ta phải tạo trên bề mặt mẫu một lớp kim loại (thường là vàng hoặc platin).
Trong kính hiển vi điện tử quét có dùng các thấu kính, nhưng chỉ để tập trung chùm điện tử thành điểm nhỏ chiếu lên mẫu chứ không dùng thấu kính để phóng đại. Cho tia điện tử quét trên mẫu với biên độ nhỏ d (cỡ micromet) còn tia điện tử quét trên màn hình với biên độ lớn D (tuỳ theo kích thước màn hình), ảnh có độ phóng đại D/d. Ảnh được phóng đại theo phương pháp này thì mẫu không cần phải cắt lát mỏng và phẳng, cho phép quan sát được mẫu kể cả khi bề mặt mấp mô.
Độ phóng đại của kính hiển vi điện tử quét thông thường từ vài chục ngàn đến vài trăm ngàn lần, năng suất phân giải phụ thuộc vào đường kính của chùm tia chiếu