5. Điểm mới của đề tài
1.3.3. Ứng dụng dây nano PPy trong cảm biến DNA
Polyme dẫn đặc biệt hấp dẫn các nhà nghiên cứu vật liệu nhờ kết hợp
đƣợc tính dẫn điện của kim loại với các tính chất của polyme hữu cơ, chúng đang ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực công nghệ cao ví dụ
trong vật liệu chống tĩnh điện, vật liệu phủ hấp thụsóng điện từ, tụđiện, các linh
kiện điện tử, linh kiện phát quang, các dây thần kinh nhân tạo, bảo vệ chống ăn mòn, bộ cảm biến, ... [43]. Polyme dẫn có tiềm năng ứng dụng cao trong lĩnh
vực cảm biến hóa học và sinh học, một lĩnh vực đòi hỏi độ nhạy, độ chọn lọc cao. Polyme dẫn dễ dàng đƣợc tổng hợp bằng phƣơng pháp hóa học hoặc điện
hóavà cấu trúc mạch đại phân tử của chúng có thể biến tính khá dễdàng bởi quá trình đồng trùng hợp hay sử dụng các dẫn xuất. Hơn nữa, các polyme dẫn có cơ tính tốt cho phép gia công cảm biến khá dễ dàng. Vì vậy mà việc chế tạo cảm biến từ polyme dẫn ngày càng đƣợc quan tâm nghiên cứu và các bài báo liên quan đƣợc công bốngày càng nhiều.
Với vai trò làm lớp vật liệu trung gian giữa cảm biến và bộ chuyển đổi, vật liệu polime dẫn góp phần làm tăng độ nhạy, độ chính xác, độ ổn định của cảm biến sinh học [44]. Trong các vật liệu polime dẫn, PPy đƣợc nhận định là thích hợp ứng dụng trong cảm biến sinh học điện hóa nhờ khả năng tạo ra cấu
trúc nano với diện tích bề mặt lớn, khả năng tạo liên kết tốt với đối tƣợng sinh học, khả năng biến tính đểđiều khiển độ dẫn [45], do đó góp phần cải thiện tỷ lệ tín hiệu/nhiễu, nâng cao độ nhạy, độ ổn định của cảm biến sinh học. Đối với việc phát hiện các phần tử sinh học tại môi trƣờng pH tự nhiên của cơ thể động vật, PPy có ƣu điểm hơn so với một số polyme dẫn khác do đƣợc tổng hợp từ
monome tại môi trƣờng pH trung tính [46]. Bên cạnh đó, PPy cũng thể hiện những đặc tính nhƣ độ bền cao, dễ tổng hợp và độ dẫn tốt.
22
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Tổng hợp PPY bằng phƣơng pháp điện hóa
2.1.1. Hóa chất, thiết bị
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng:
- Pyrrole monomer, Gelatin, KCl, K2Cr2O7 99%, H2SO4 98%, N2 99.9%, LiClO4.3H2O, đệm PBS (Phosphate buffer saline), tất cả đƣợc cung cấp bởi Sigma-Aldrich. Mẫu ADN đƣợc cung cấp bởi công ty Invitrogen Life Technologies. Trình tự ADN dò, ADN đích đặc hiệu đƣợc thể hiện trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự chuỗi ADN dò, ADN đích đặc hiệu
Chuỗi dò Thiol-C6-5’- AGACCTCCAGTCTCCATGGTACGTC-3’
Chuỗi bổ sung đặc hiệu 5’–GACGTACCATGGAGACTGGAGGTCT–3’
2.1.2. Qui trình chế tạo
2.1.2.1. Chuẩn bị
Chúng tôi sử dụng kỹ thuật chronoamperometry (potentiostatic) để tổng hợp PPy-NWs trên nền điện cực răng lƣợc vàng, kỹ thuật này còn gọi là kỹ thuật
dòng - thời gian. Điện thế 0.75 v đƣợc áp lên điện cực làm việc BG, sự biến đổi của dòng điện trên điện cực này đƣợc ghi theo thời gianTrƣớc khi tổng hợp dây nano PPy, điện cực làm việc đƣợc xử lý bề mặt trong dung dịch K2Cr2O7/H2SO4
(bão hòa), rồi đƣợc hoạt hóa trong dung dịch H2SO4 0,5 M bằng kỹ thuật điện
hóa quét thế tuần hoàn (CV- Cyclic Voltammetry) ở điện áp từ 0 V đến 1,4 V, tốc độ quét 50 mV/s cho đến khi đặc trƣng CV ổn định. Dây nano PPy đƣợc tổng hợp trong môi trƣờng trung tính, pH = 7,4 của PBS. Dung dịch điện li đƣợc pha chế gồm: monome pyrrole, 0,08% về khối lƣợng gelatin, LiClO4 0,1 M và đệm PBS. Trƣớc khi thêm monome pyrrole, dung dịch điện li đƣợc sục khí N2
trong 15 phút để đuổi oxi hòa tan, là tác nhân gây ra phản ứng phụ oxi hóa không mong muốn đối với pyrrole.
23
2.1.2.2. Quá trình chế tạo
Các điện cực răng lƣợc vàng nền silic đƣợc sử dụng để tổng hợp PPy- NWs. Sau khi cốđịnh ADN dò, các điện cực đƣợc sử dụng đểphát hiện nồng độ
ADN thông qua quá trình lai hóa giữa các ADN dò và ADN đích.
Hình 2.1. Sơ đồ quá trình sửa đổi bề mặt của bộ cảm biến răng lƣợc. Từtrái
sang phải: Điện cực răng lƣợc vàng, BG/PPy- NWs, BG/PPy-PPy/ADN dò và
BG/PPy-PPy/lai hóa ADN.
Sơ đồ kết nối các các điện cực đƣợc trình bày trong hình 2.2. Quá trình
tổng hợp dây nano PPy đƣợc thực hiện trên hệ điện hóa AutoLab PGSTAT12, Eco Chemie, Hà Lan. Bình điện hóa sử dụng điện cực BG là điện cực làm việc,
điện cực đối Platin và điện cực so sánh Ag/AgCl trong dung dịch KCl bão hòa, hình 2.2.
Hai thí nghiệm trùng hợp đƣợc thực hiện theo các cấu hình kết nối nhƣ trong hình 2.2c: (i) điện cực 1 và 2 đƣợc nối với nhau nhƣ là điện cực làm việc; (ii) tất cả4 điện cực đƣợc nối với nhau làm điện cực làm việc. Sự trùng hợp PPy
trên bề mặt điện cực với thời gian là 200 s. Bề mặt điện cực vàng (ký hiệu là điện cực BG) đƣợc biến đổi với các dây nano Polypyrrole (ký hiệu là điện cực PPy-NWs). Sau khi ủtrong môi trƣờng thƣờng trong một ngày, bề mặt đƣợc rửa sạch bằng nƣớc khử ion (DI) năm lần. Cố định ADN đƣợc thực hiện bằng cách tiêm lên bề mặt điện cực3 μl dung dịch chứa ADN dò 2 μM trong PBS trên điện cực BG, PPy-NWs.
24
Các điện cực đƣợc để khô trong môi trƣờng thƣờng trong một ngày, sau đó rửa sạch bằng nƣớc DI năm lần để loại bỏ các phân tử ADN dò liên kết yếu hoặc không liên kết với PPy-NWs. Quá trình lai hóa DNA đƣợc nghiên cứu bằng cách tiến hành đo phổ tổng trở (EIS) của các cảm biến đƣợc kết nối với cấu
hình kết nối (iii) trong hình 2.2c. Các phân tích EIS đƣợc thực hiện bằng cách sử
dụng Autolab PGSTAT302N (Metrohm Autolab B.V., Utrecht, Hà Lan) với hệ ba điện cực thông thƣờng. Một điện thế với mô đun 250 mV DC và ± 10 mV
AC với tần số 0,1 Hz – 10 kHz đƣợc áp lên điện cực làm việc. Tất cả các phép đo BIS thực hiện trong 10 mM [Fe(CN)6]3−/4−; 0,1 M KCl làm chỉ thị hoạt động
oxy hóa. Các kết quả EIS sau đó đƣợc xem xét tƣơng ứng với một mạch tƣơng đƣơng (trong trƣờng hợp của chúng tôi, đó là mạch Randle) bằng cách sử dụng phần mềm ZsimpWin 3.10. Thiết lập EIS giống nhƣ thiết lập tổng hợp dây nano
PPy nhƣ trong hình 2.2b. Hình thái học của bề mặt vật liệu và điện cực đã đƣợc
nghiên cứu trên kính hiển vi điện tử quét của Hitachi S4800 (SEM).
Hình 2.2. (a) Sơ đồ mặt trƣớc của cảm biến đƣợc gồm 4 điện cực (ký hiệu là 1– 4). (b) Sơ đồ của quá trình trùng hợp polypyrrole và thiết lập đo lƣờng EIS. (c)
Ba cấu hình kết nối của bốn nhánh điện cực: (i) và (ii) cho trùng hợp
25
Trong hình 2.2, các cảm biến đƣợc mô tả trong 2.2a đóng vai trò là điện cực làm việc (WE). WE với điện cực counter (CE) và điện cực so sánh (RE) hình thành một hệ thống ba điện cực thông thƣờng.
Ảnh hƣởng của nồng độ monome pyrrole, thời gian ttổng hợp đến sự hình thành vật liệu polyme dẫn PPy đƣợc nghiên cứu nhằm tìm ra những thông số tối
ƣu cho quá trình tổng hợp dây nano PPy định hƣớng ứng dụng trong cảm biến sinh học.
2.2. Các phƣơng pháp phân tích
2.2.1. Phương pháp quét thế tuần hoàn vòng (CV)
Voltammetry cyclic là phƣơng pháp điện hóa thực hiện phép đo dòng điện sinh ra trong một pin điện hóa trong điều kiện điện áp vƣợt quá giới hạn theo
phƣơng trình Nernst.
Nguyên lí của phƣơng pháp CV là áp đặt một điện thế biến đổi tuần hoàn vào điện cực làm việc (WE) và ghi lại dòng tƣơng ứng. Đối với phƣơng pháp này, điện thế biến thiên tuyến tính theo thời gian, dòng đƣợc ghi nhƣ hàm số của
điện thế. Trong phƣơng pháp đo này, bề mặt điện cực phải đƣợc phục hồi trƣớc
khi đo, dung dịch không có sự khuấy trộn và chuyển khối theo sự khuếch tán. Đƣờng cong phân cực biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ dòng I và thế E, phụ
thuộc vào dung môi, chất điện li nền và bản chất điện cực [47].
26
Trog đó: ipavà ipclà dòng điện tại anot và catot
Epavà Epclà điện thế tại anot và catot
2.2.2. Phương pháp đo tổng trở (EIS).
a. Nguyên lý của phổ tổng trở điện hóa
Khi ta cho một dao động biên độ nhỏ xoay chiều hình sin U0, tần số góc 2 f
đi qua một hệ điều hòa (hình 2.2), trong mạch sẽ xuất hiện một dòng điện đáp ứng hình sin có biên độ I0 cùng tần số góc nhƣng lệch pha một góc
so với điện thếđƣa vào.
Hình 2.4: Sơ đồ khối mô phỏng nguyên lý đo tổng trở u = Uo sint
i = Io sin (t + )
Theo định luật Ohm có thểđịnh nghĩa tổng trởZ nhƣ sau:
Z = u/i = f ()
Tính chất của Z () là:
Z () là một vectơ có modun Z và góc lệch pha
Z () là một hàm phức: Z () = Zre + jZim Ta có thể biểu diễn hình học của Z () trên mặt phẳng phức nhƣ sau : Ta có: Z Z Z sin i im Zr Zre Z cos 2 2 2 Hay Z Zr Z i Bình điện hóa
27
Hình 2.5. Biểu diễn hình học các phần tử phức
Khảo sát đặc tính tần số Z = f () cho phép xác định cácđại lƣợng Z , Zr, Zivà góc lệch pha = arctg (Zi/Zr).
Tổng trở Z của bình điện hóa bao gồm các thành phần nhƣ: tổng trở của
quá trình Faraday Zf, điện dung của lớp kép coi nhƣ một tụđiện Cdvà điện trở R - là điện trở dung dịch giữa điện cực nghiên cứu và điện cực so sánh. Kỹ
thuật xửlý toán học cho ta tính đƣợc các giá trị Cd, R, Zf… và cho đến các thông sốđộng học cuối cùng của hệ điện hóa (io, ko, D…). Kết quả nhận đƣợc
thƣờng đƣợc biểu diễn dƣới dạng đồ thịthƣờng gọi là phổ(Nyquits, Bode…).
b. Mạch tương đương trong phổ tổng trở
Sơ đồ mạch tƣơng đƣơng thể hiện hành vi của bình điện hóa đƣợc thể
hiện trên hình 1.14
Hình 2.6. Mạch tƣơng đƣơng ứng với hệ điện hóa bị khống chế bởi quá trình
chuyển điện tích R: Điện trở dung dịch Phần thực, Zr Ph ầ n ả o , Z1 Zf Cd
28 Zf: Tổng trở của quá trình Faraday
Cd: Điện dung của lớp kép
Trong đồ thị, quan hệ – Zi theo Zr sẽ nhận đƣợc cung bán nguyệt với bán kính bằng (Rp-Rdd)/2. Có thểxác định Rp, Rdd (hay R) tại điểm cắt của cung
này với trục Zr. Điện dung Cdcó thểxác định từ Rpvà giá trị tần số fmax của cực
đại tổng trởảo – Zi.
c. Tổng trở khuếch tán Warburg
Tổng trở khuếch tán hay còn gọi là tổng trởWarburg, kí hiệu là ZWđƣợc
tính bởi: ZW = (1-j) 1/ 2 Trong đó: 2 0 0 RT nF .C 2D là hằng số Warburg
Mạch tƣơng đƣơng của tổng trở Warburg gồm một điện trởvà một tụđiện mắc nối tiếp nhƣ hình 2.7.
Hình 2.7. Mạch tƣơng đƣơng tổng trở khuếch tán Warburg
d. Tổng trở Randles
Trong trƣờng hợp phản ứng điện cực bị khống chế bởi cả giai đoạn chuyển
điện tích và khuếch tán ta có tổng trở Ersler – Randles
o r r ct Z R 1 j Trong đó: RW CW
29 o 2 * o 0 RT nF C 2D và R 2 * R R RT nF C 2D Đặt o R Cuối cùng ta có: ZR = Rct + (1-j) -1/2
Sơ đồ tổng quát của trở Randles đƣợc mô tảtrên hình 1.16:
Hình 2.8. Sơ đồ tƣơng đƣơng của bình điện phân
Điện trở chuyển điện tích Rct thƣờng đƣợc xác định bằng cách ngoại suy tổng trởở tần số thấp về Zi = 0
2.2.3. Kính hiển vi điện tửquét ( SEM)
Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope, thƣờng viết tắt
là SEM), là một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử (chùm các electron)
hẹp quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật đƣợc thực hiện thông qua
việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từtƣơng tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật. Việc phát các chùm điện tử trong SEM cũng giống nhƣ việc tạo
ra chùm điện tử trong kính hiển vi điện tử truyền qua, tức là điện tử đƣợc phát ra
từ súng phóng điện tử (có thể là phát xạ nhiệt, hay phát xạ trƣờng...), sau đó đƣợc tăng tốc. Điện tử đƣợc phát ra, tăng tốc và hội tụ thành một chùm điện tử
hẹp (cỡ vài trăm Angstrong đến vài nanomet) nhờ hệ thống thấu kính từ, sau đó quét trên bề mặt mẫu nhờ các cuộn quét tĩnh điện. Kính hiển vi điện tử quét đƣợc sử dụng để kiểm tra sơ bộ sự thay đổi hình thái bề mặt điện cực: trƣớc và
sau khi xốp hóa điện cực.
Clk
W Rp
30
2.2.4. FTIR, Raman
Phƣơng pháp phân tích phổ hồng ngoại FTIR và Raman cho ta xác định
đƣợc đặc trƣng cấu trúc điện tử của phân tử polyme.
2.2.4.1. Phổ hồng ngoại FTIR
Phổ hồng ngoại đƣợc sử dụng rộng rãi trong những kỹ thuật phân tích rất hiệu quả và đã trải qua ba thập kỷ qua. Một trong những ƣu điểm quan trọng nhất của phƣơng pháp phổ hồng ngoại vƣợt hơn những phƣơng pháp phân tích
cấu trúc khác (nhiễu xạ tia X, cộng hƣởng từ điện tử, phƣơng pháp quang …) là phƣơng pháp này cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi
các phƣơng pháp tính toán phức tạp. Kỹ thuật này dựa trên hiệu ứng đơn giản là: các hợp chất hoá học có khả năng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại. Sau khi hấp thụcác bức xạ hồng ngoại, các phân tử của các hợp chất hoá học dao động với nhiều vận tốc dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại. Mục tiêu của các quang phổ nói chung là để đo mức mẫu hấp thụ ánh sáng ở mỗi bƣớc sóng nhƣ thế nào. Phép phân tích đƣợc thực hiện
trong vùng bức xạ hồng ngoại có số sóng 4000 - 400 cm-1.
2.2.4.2. Phổ Raman
Quang phổ Raman là một kỹ thuật quang phổ dựa trên sự tán xạ không đàn hồi của ánh sáng đơn sắc thƣờng đƣợc phát từ một nguồn laser. Tán xạ không đàn hồi là hiện tƣợng tần số của các Photon trong ánh sáng đơn sắc bị thay đổi khi tƣơng tác với mẫu. Các photon của ánh sáng laser đƣợc mẫu hấp thụ rồi sau đó lại đƣợc phát xạ lại. Tần số của các photon phát xạ lại bị thay đổi
tăng hoặc giảm so với tần số ánh sáng đơn sắc ban đầu, đƣợc gọi là hiệu ứng Raman. Sự thay đổi này cho biết thông tin về sự dao động, xoay vòng và các thay đổi tần số thấp khác trong phân tử. Quang phổRaman có thể đƣợc sử dụng
để nghiên cứu các mẫu khí, lỏng và rắn. Để quan sát quang phổ Raman, cần
31
Hình 2.9. Sơ đồ quang của máy quang phổ Raman
Trong thiết bị quang phổtán xạ Raman, nguyên lý trên áp dụng bằng việc tập trung ánh sáng tán xạ raman lên cách tử nhiễu xạ, cách tử này phân tách chùm sáng thành các bƣớc sóng thành phần. Các tia sáng này đƣợc đƣa đến một thiết bị cảm biến điện tích kép CCD hoặc ống tích điện silicon. Thƣờng hoạt
động ởvùng nhìn thấy. Các bƣớc sóng hay dùng: 780 nm, 633 nm, 532 nm, and 473 nm… Các sóng laze kích thích ngắn hơn lại cho tín hiệu phổ Raman mạnh
hơn. Tuy nhiên ởbƣớc sóng ngắn lại hay gặp hiện tƣợng phổ huỳnh quang. Có
thể sử dụng phần mềm và một số biện pháp khác để khắc phục loại bỏ nhiễu huỳnh quang này, nhƣng nếu phổ huỳnh quang đủ lớn có thể bão hòa CCD và không thểđo đƣợc phổ Raman.
32
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc tuyến điện hóa của hệ điện cực răng lƣợc vàng
Đặc tuyến điện hóa của hệ điện cực tích hợp Pt đƣợc khảo sát sử dụng
phƣơng pháp CV, dung dịch điện li gồm K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M trong KCl 0,1 M, tốc độ quét 50 mV/s, khoảng thế quét -0,2 – 0,6 V, thực hiện 5 vòng