3.2.3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)
Bảng 3.3. Kết quả phổ 1H-NMR của các các chất
Công thức cấu tạo
Dữ liệu phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6), δ (ppm) Phụ lục 10,43 (1H, s, N-H); 9,30 (1H, s, H-5); 8,86 (1H, s, H-8), 8,59 (1H, s, H-2), 8,13 (1H, dd, J’=2,4 Hz, J=6,6 Hz, H-2c); 7,94 (2H, d, J=8,4 Hz, H-2b, H-6b); 7,79-7,76 (2H, m, H-5c, H-6c), 7,50-7,45 (2H, m, H-3b, H-5b), 2,42 (3H, s, 7b) 11
32 9,78 (1H, s, NH amid); 9,43 (1H, s, NH amin); 8,95 (1H, s, H-2); 8,51 (1H, s, H-5); 8,11 (1H, dd, J1 = 2,4 Hz, J2 = 7,2 Hz, H-8); 7,81-7,78 (1H, m, H-6c); 7,39 (1H, dd, J1 = J2 = 9,0 Hz, H-5c); 7,21 (1H, s, H-2c); 6,81 (1H, dt, J1 = 6,0 Hz, J2 = 15,0 Hz, H-3d); 6,59 (1H, d, J = 15,0 Hz, H- 2d); 5,26 (1H, br.s, H- 1b); 4,01-3,97 (2H, m, H-4b); 3,94-3,90 (1H, m, H-2b); 3,79-3,75 (1H, m, H-2b); 3,08 (2H, d, J = 6,0 Hz, H-4d); 2,33 (1H, sextet, J = 6,6 Hz, H-5b); 2,17 (6H, s, H-6, H-7); 2,16 (1H, sextet, J = 6,6 Hz, H-5b) 12 10,00 (1H, br.s, H- amid); 9,76 (1H, s, H (amin N-H)); 8,94 (1H, s, H-5); 8,58 (1H, s, H- 2); 8,10 (1H, dd, J1 = 2,1 Hz, J2 = 6,6 Hz, H-2c); 7,79-7,76 (1H, m, H-6c); 7,44 (1H, dd, J1 = J2 =9,0 Hz, H-5c); 7,27 (1H, s, H-8); 6,80-6,76 (2H, m, H-2d, H-3d); 6,14 (4H, s, H-2e, H-3e); 5,31 (1H, s, H-1b); 4,00-3,91 (4H, m, H-4d, H-4b); 3,93 (1H, dd, J1 = J2 =7,8, H-2b); 3,80- 3,77 (1H, m, H- 2b); 2,83 (6H, s, H-6d, H-7d); 2,37 (1H, ddd, J1 = J2 = J3= 6,6 Hz, H- 5b); 2,13 (1H, p, J =6,6 Hz, H-5b) 13
33
Độ dịch chuyển hoá học (δ) được lấy theo giá trị trung bình (ppm); các ký hiệu viết tắt: s: singlet; br.s: singlet tù; d: doublet; dd: doublet doublet; dd: doublet doublet doublet; t: triplet; dt: doublet triplet; m: multiplet; p: pentet.
3.2.3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13C-NMR
Bảng 3.4. Kết quả phổ 13C-NMR của các các chất
Công thức cấu tạo
Dữ liệu phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6), δ (ppm) Phụ lục C-4 158,36 14 C-2 157,84 C-4c 154,79 153,17 C-8a 151,16 C-6 145,32 C-1b 143,26 C-1c 137,32 C-7 136,63 C-4b 135,32 C-8 132,57 C-3b, C-5b 130,01 C-3c 128,17 128,01 C-6b, C-2b 128,10 C-4a 124,09 C-2c 122,89 122,85 C-5 122,78 C-6c 119,12 119,00 C-5c 117,14 C-7b 21,12 C-1d 163,66 15 C-4 156,77 C-4c 153,98 152,37 C-7 153,83 C-2 153,15 C-8a 148,66 C-3d 142,19 C-1c 136,81 136,80 C-2d 127,55 C-6 125,82 C-2c 123,51
34 C-6c 122,37 122,33 C-3c 118,77 118,65 C-5c 116,44 116,30 C-5 115,93 C-4a 108,93 C-8 107,99 C-1b 78,81 C-4b 72,01 C-2b 66,60 C-4d 59,77 C-6d, C-7d 45,12 C-5b 32,40 3.3. Bàn luận 3.3.1. Bàn luận về các phản ứng tổng hợp hóa học 3.3.1.1. Phản ứng tạo N-(3-cloro-4-florophenyl)-6-nitro-7-tosylquinazolin-4-amin - Bàn về cơ chế phản ứng:
Phản ứng trải qua 2 giai đoạn: clor hóa và amin hóa. Cơ chế được mô tả trong hình 3.9 và 3.10.
Giai đoạn clor hóa:
Hình 3.9. Cơ chế giai đoạn clor hóa hợp chất 4
35
Hình 3.10. Cơ chế giai đoạn amin hóa tạo chất 5
- Bàn luận về tác nhân sử dụng:
Sử dụng hỗn hợp tác nhân SOCl2 và POCl3: thionyl clorid là một tác nhân mạnh, tuy nhiên, với những phản ứng sử dụng thionyl clorid tương tự đã được công bố, tác giả sử dụng tác nhân này với tỉ lệ rất cao[36], [39]. Việc cất loại thionyl clorid sau khi kết thúc phản ứng clor hóa cũng là một vấn đề đáng lưu tâm, vì sản phẩm clor hóa là sản phẩm trung gian rất kém bền. Quá trình cất quay và xử lý tác nhân clor hóa dư càng lâu sẽ càng dẫn tới việc dễ nhiễm nước vào sản phẩm trung gian này. Ngoài ra, trên thực tế chúng tôi đã thực hiện phản ứng clor hóa 4 bằng thionyl clorid đơn lẻ nhưng kết quả cho quá trình clor hóa không hoàn toàn. Vì vậy chúng tôi đề xuất việc kết hợp 2 tác nhân clor hóa cho phản ứng này, để làm tăng khả năng thế clo và giúp giảm tỉ lệ mol sử dụng 2 tác nhân, cụ thể là SOCl2 và POCl3.
Quá trình clor hóa sinh ra khí HCl, dễ dàng loại đi sau phản ứng; phản ứng clor hóa ít tạp, có thể thực hiện luôn phản ứng amin hóa sau đó.
Về tác nhân amin hóa: amin thơm 3-cloro-4-floroanilin không phải là một base Lewis quá mạnh, do ảnh hưởng của nhân thơm và 2 nhóm thế –F và – Cl. Chính vì vậy, để tăng tính base cùng với tính Nucleophil cho N này, cần
thêm xúc tác bởi triethylamin (cơ chế đã được đề cập ở phần trên). Đồng thời TEA phản ứng với HCl, giúp phản ứng chuyển dịch cân bằng về phía tạo sản
36
phẩm 5 (theo nguyên lý chuyển dịch cân bằng Le Chatelier [56]); TEA phản ứng với HCl tạo ra muối, muối này dễ dàng loại bỏ bằng nước sau phản ứng. Trung gian imidoyl clorid 4-cloro-6-nitro-7-tosylquinazolin chỉ có một vị trí có thể tham gia phản ứng thế với tác nhân là vị trí C4, nên không có cạnh tranh phản ứng thế các vị trí trong nhân thơm ở giai đoạn này, phản ứng chọn lọc. - Bàn luận về điều kiện và xử lý phản ứng:
Như đã phân tích ở trên, trung gian imidoyl clorid rất dễ bị nhiễm ẩm và thủy phân về chất 4 ban đầu. Đồng thời, SOCl2 và POCl3 dễ tác dụng với nước tạo các sản phẩm phụ HCl, H2SO3, H3PO4; gây bất lợi cho phản ứng, giảm hiệu suất. Vì vậy, chúng tôi đề xuất 2 giải pháp cho vấn đề này, đó là (1) thực hiện one-pot cho phản ứng tạo chất 5 từ 4 và (2) thực hiện phản ứng clo hóa trong môi trường đảm bảo hoàn toàn khan nước.
Chúng tôi sử dụng toluen để loại tác nhân clor hóa còn dư, do toluen có đặc tính không hòa tan trong nước, không kéo nước. Sản phẩm amin hóa 5 chạy sắc ký cho một vết sản phẩm (mục 3.1.4), không có vết tạp, chứng tỏ tác nhân dư của quá trình clor hóa đã được loại bỏ, không ảnh hưởng đến phản ứng amin hóa.
3.3.1.2. Phản ứng tạo afatinib qua trung gian anhydrid hỗn tạp
- Bàn về cơ chế phản ứng:
Phản ứng tạo (E)-2-ethylbutanoic (E)-4-(dimethylamino)but-2-enoic anhydrid Phản ứng trải qua 2 giai đoạn: giai đoạn tạo acyl clorid và giai đoạn tạo dẫn xuất anhydrid. Cơ chế được mô tả ở hình 3.11 và 3.12.
Giai đoạn 1: tạo dẫn chất acyl clorid
37
Ở giai đoạn này, hỗn hợp oxalyl clorid và DMF tạo thành tác nhân Vilsmeier, đóng vai trò như một Electrophil, rồi Nucleophil acid 2-ethylbutanoic tấn công vào nhờ cặp e tự do trên O, tiếp tục tách loại thu được acyl clorid phục vụ cho giai đoạn tiếp theo.
Giai đoạn 2: tạo dẫn xuất anhydrid
Hình 3.12. Cơ chế tạo dẫn xuất anhydrid
Giai đoạn tạo dẫn xuất anhydrid tuân theo cơ chế ái điện tử. Cl-là nhóm hút điện tử mạnh, tác nhân acyl 2-ethylbutanoyl clorid dễ dàng phân ly thành cation acyli để acid (E)-4-(dimethylamino)but-2-enoic tấn công vào, dưới sự trợ giúp của TEA.
Phản ứng tạo afatinib
Cơ chế acyl hóa tuân theo cơ chế ái điện tử được mô tả dưới hình 3.13.
Hình 3.13. Cơ chế tạo afatinib bằng anhydrid hỗn tạp
7b là một anhydrid hỗn tạp có tính acyl hóa mạnh; amin thơm là một amin
có cấu trúc cồng kềnh, tính nucleophil yếu. Việc Nucleophil tấn công vào gốc acyl nào phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: tính ổn định của carbocation, nhóm rời, hiệu ứng không gian, tổng năng lượng có ích.
38
Có 2 trường hợp xảy ra phân ly tác nhân acyl hóa như sau:
Hình 3.14. Sơ đồ phân tích carbocation
Chúng tôi giải thích việc Nuclephil amin thơm ưu tiên tấn công vào carbocation C1 với những lý do:
Carbocation C1 bền hơn C2 do có sự giải tỏa nhờ hiệu ứng liên hợp.
Hiệu ứng không gian của C2 làm cho Nucleophil khó tấn công. Mặc dù carbocation C2 có 2 nhóm ethyl với hiệu ứng cảm ứng +I ở vị trí α giúp làm tăng độ bền cho C2, nhưng chính 2 nhóm này lại làm cản trở việc Nu- tấn công vào carbocation này; vì bản thân Nu- có khung cấu trúc rất cồng kềnh, lại gặp cản trở không gian bởi 2 nhóm ethyl ở 2 bên.
Sản phẩm tạo ra bền nhờ hệ liên hợp kéo dài. - Bàn về tác nhân sử dụng:
Về tác nhân clor hóa, chúng tôi sử dụng oxalyl clorid. Đây là tác nhân có khả năng phản ứng vừa phải, chọn lọc, không có tính oxi hóa cao. Điều này rất phù hợp để làm phản ứng tiếp theo trong điều kiện phản ứng one-pot như hiện tại. Vì phản ứng kế tiếp là phản ứng với amin thơm, amin này rất dễ bị phản ứng với một tác nhân clor hóa mạnh còn dư tạo sản phẩm phụ. Đồng thời, oxalyl clorid phản ứng cho sản phẩm phụ là khí carbonic, khí này có thể xử lý bằng kiềm dễ dàng khi nâng cấp quy mô.
Về tỉ lệ tác nhân sử dụng, chúng tôi sử dụng tác nhân oxalyl clorid có tỉ lệ với acid 2-ethylbutanoic là 1,2:1; không dùng dư nhiều (COCl)2. Bởi lẽ
39
(COCl)2 cũng có khả năng phản ứng với amin 7, cạnh tranh phản ứng với anhydrid 7b dẫn tới giảm hiệu suất.
Về tác nhân anhydrid hỗn tạp, đây là tác nhân acyl hóa mạnh, do amin thơm có tính nucleophil yếu nên cần sử dụng tác nhân acyl hóa mạnh để tăng khả năng phản ứng. Đây là tác nhân mới, chưa từng được sử dụng trước đây trong con đường tổng hợp afatinib. Qua thực nghiệm cho thấy việc sử dụng tác nhân này làm giảm được lượng acid (E)-4-(dimethylamino)but-2-enoic đáng kể so với các phương pháp tổng hợp đã làm trước đây, giúp giảm giá thành vì đây là acid rất đắt tiền. Cụ thể, chúng tôi sử dụng tỉ lệ acid (E)-4- (dimethylamino)but-2-enoic : amin 7 = 1,2:1,0; tỉ lệ này thấp hơn nhiều so với phương pháp đã nghiên cứu, tỉ lệ này là 2,0:1,0 [3].
- Bàn luận về các sản phẩm phụ:
Các sản phẩm phụ có thể gặp phải trong giai đoạn tạo anhydrid hỗn tạp:
Hình 3.15. Các sản phẩm phụ trong quá trình tạo anhydrid hỗn tạp
Các sản phẩm phụ có thể tạo ra trong quá trình này là O1, O2, do quá trình ether hóa 2 gốc acyl giống nhau, tạo sản phẩm anhydrid đối xứng.
Tuy nhiên, khi phân tích định tính bằng phổ MS, chúng tôi không quan sát được pic của sản phẩm phụ O1. Ngoài ra, chúng tôi quan sát thấy trên phổ [M+H]+ xuất hiện một pic là 129,9; chúng tôi cho rằng đây có thể là pic của anhydrid hỗn tạp bị phân hủy hoặc pic của sản phẩm phụ O2 bị phân hủy trong quá trình đo (sơ đồ phân hủy xem hình
3.20). Kết quả phổ [M+H]+ được mô tả dưới hình 3.16. Như vậy, trong quá trình tạo anhydrid hỗn tạp có thể tạo thành sản phẩm phụ O2.
40
Hình 3.16. Phổ [M+H]+ của dịch anhydrid hỗn tạp và pic sản phẩm phân hủy
Các sản phẩm phụ có thể gặp phải trong quá trình tổng hợp afatinib bằng anhydrid hỗn tạp 7b - giai đoạn acyl hóa:
Hình 3.17. Các sản phẩm phụ có thể có trong quá trình tạo afatinib
Các sản phẩm phụ có thể là A1 (amin gắn với gốc acyl 2-ethylbutanoyl), hoặc A2 (sản phẩm tấn công 1-4). Tuy nhiên, kết quả phổ khối MS của hỗn hợp dịch afatinib
41
A1-tạp amid chéo (m/z [M+H]+ lý thuyết là 473,18). Kết quả được thể hiện ở hình 3.18.
Hình 3.18. Phổ [M+H]+ của dịch afatinib chưa tinh chế và pic sản phẩm phụ
Sau giai đoạn tinh chế, tiếp tục thực hiện định tính các tạp bằng phổ khối MS thì chúng tôi không quan sát thấy pic của tạp chất A1 này trên phổ khối (phụ lục 9a,9b).
Tiếp tục thực hiện định tính bằng phổ IR và 1H-NMR, 13C-NMR thì không còn thấy pic của tạp chất này trên các phổ (phụ lục 12, 14). Chứng tỏ sau quá trình tinh chế, tạp A1 đã bị loại bỏ, quá trình tinh chế thu được afatinib sạch. Chúng tôi xin được bàn luận kỹ hơn tại mục 3.3.2.
3.3.2. Bàn luận về kết quả phân tích phổ
3.3.2.1. Phổ khối (MS) và phổ khối phân giải cao (HRMS)
Chất 4: Phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH): xuất hiện pic ion phân tử [M+H]+ = 346,3 phù hợp với công thức phân tử C15H11N3O5S, m/z lý thuyết [M+H]+
=346,05.
Chất 5: Phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH): xuất hiện pic ion phân tử [M-H]- = 470,7 phù hợp với công thức phân tử C21H14ClFN4O4S, m/z lý thuyết [M-H]-
=471,03.
Trung gian imidoyl clorid 4a (HR-MS, MeOH): xuất hiện pic ion phân tử [M+H]+ = 346,0502 tương ứng với công thức phân tử [C15H11N3O5S+H]+ =346,0498, không thấy pic ứng với công thức phân tử [C15H10ClN3O4S+H]+=364,0159 (phụ lục 10). Điều này chứng tỏ trong quá trình đo phổ, imidoyl clorid 4a đã bị chuyển về dạng sulfon ban đầu 4. (hình 3.19). Chứng minh imidoyl clorid 4a là một chất
42
kém bền với ẩm, thực hiện one-pot với quá trình clor hóa-amin hóa chất 4 là hoàn toàn hợp lý.
Hình 3.19. Sự phân hủy imidoyl clorid 4a về hợp chất 4
Chất 7 (ESI-MS, MeOH): xuất hiện pic ion phân tử [M-H]- = 372,9 và [M+H]+ = 374,9 phù hợp với m/z lý thuyết [M-H]- = 373,07 và [M+H]+ = 375,10 ứng với công thức phân tử C18H16ClN4O2.
Hỗn hợp anhydrid hỗn tạp (ESI-MS, MeOH): trên phổ [M+H]+ chúng tôi quan sát thấy sự xuất hiện của pic 227,9; tương ứng với công thức phân tử C12H21NO3
m/z [M+H]+ lý thuyết = 228,16. Ngoài ra, trên phổ chúng tôi quan sát thấy pic 144,0, ứng với công thức phân tử C7H13NO2 m/z [M+H]+ lý thuyết = 144,10; chất này là kết quả của quá trình acyl hóa giữa anhydrid hỗn tạp và dung môi methanol trong quá trình đo.
Hình 3.20. Quá trình acyl hóa giữa anhydrid hỗn tạp và methanol
Trên phổ MS này còn chỉ ra pic 129,9 với cường độ nhỏ ứng với công thức C6H11NO2 với m/z [M+H]+ lý thuyết là 130,09, là sản phẩm thủy phân của anhydrid hỗn tạp hoặc có thể của tạp O2 do ảnh hưởng của dung môi (hình 3.21).
43
Hình 3.22. Phổ [M+H]+ của anhydrid hỗn tạp và các pic phân tích
Ngoài ra, qua phân tích phổ [M-H]- chúng tôi cũng quan sát thấy pic 127,9 với cường độ yếu; tương ứng với công thức phân tử C6H11NO2 với m/z [M-H]- lý thuyết là 128,07. (phụ lục 7b)
Qua phân tích ở trên cho thấy sản phẩm anhydrid hỗn tạp tạo ra là sản phẩm khá chọn lọc.
Afatinib thô (chưa tinh chế): trên hình ảnh phổ xuất hiện pic ion phân tử [M-H]-
= 483,9 và [M+H]+ = 486,0 (tương ứng lần lượt trên 2 phổ [M-H]- và [M+H]+ ) phù hợp với m/z lý thuyết [M-H]- = 484,16 và [M+H]+ = 486,17; ứng với công thức phân tử C24H25ClFN5O3. Chứng minh sự có mặt của afatinib trong dịch afatinib thô (hình 3.23). Đồng thời, phổ MS chỉ ra có sự xuất hiện của tạp chất
A1 do sự tấn công của Nucleophil- amin thơm vào gốc acyl 2-ethylbutanoyl (đã
44
Hình 3.23. Phổ [M+H]+ của dịch afatinib chưa tinh chế và pic của afatinib
Afatinib base (sau khi đã tinh chế): xuất hiện pic ion phân tử [M-H]- = 483,7 và [M+H]+ = 486,8 phù hợp với m/z lý thuyết [M-H]- = 484,16 và [M+H]+ = 486,17. Sau khi tinh chế, pic của tạp A1 không còn xuất hiện trên phổ [M+H]+ và [M-H]-
chứng tỏ quá trình tinh chế chọc lọc, thu được afatinib sạch. (Phụ lục 9a,9b)
3.3.2.2. Phổ hồng ngoại - IR
Chất 5: Phổ đồ xuất hiện các dải hấp thụ với các đỉnh đặc trưng cho từng nhóm chức, cụ thể như sau: đỉnh hấp thụ với số sóng 3607 cm-1 đặc trưng cho liên kết N-H, 3096 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-H no. Các đỉnh 1653, 1623 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=N; các đỉnh 1572, 1500, 1435 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=C thơm. Các đỉnh hấp thụ với số sóng 1544, 1364 cm-1 đặc trưng cho liên kết NO2; các đỉnh 1329, 1151 cm-1 đặc trưng cho liên kết SO2; đỉnh 1216 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-F.
Afatinib base: Trên phổ đồ afatinib xuất hiện các dải hấp thụ với các đỉnh đặc trưng cho từng nhóm chức, cụ thể: đỉnh hấp thụ ở 3493 cm-1 đặc trưng cho dao động hoá trị của liên kết N-H của amin, các đỉnh 3404, 3318 cm-1 đặc trưng cho liên kết N-H amid, đỉnh 3129 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-H thơm và các đỉnh hấp thụ 2981, 2866, 2846 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-H no. Tín hiệu C=O amid có đỉnh