3.3.2.1. Phổ khối (MS) và phổ khối phân giải cao (HRMS)
Chất 4: Phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH): xuất hiện pic ion phân tử [M+H]+ = 346,3 phù hợp với công thức phân tử C15H11N3O5S, m/z lý thuyết [M+H]+
=346,05.
Chất 5: Phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH): xuất hiện pic ion phân tử [M-H]- = 470,7 phù hợp với công thức phân tử C21H14ClFN4O4S, m/z lý thuyết [M-H]-
=471,03.
Trung gian imidoyl clorid 4a (HR-MS, MeOH): xuất hiện pic ion phân tử [M+H]+ = 346,0502 tương ứng với công thức phân tử [C15H11N3O5S+H]+ =346,0498, không thấy pic ứng với công thức phân tử [C15H10ClN3O4S+H]+=364,0159 (phụ lục 10). Điều này chứng tỏ trong quá trình đo phổ, imidoyl clorid 4a đã bị chuyển về dạng sulfon ban đầu 4. (hình 3.19). Chứng minh imidoyl clorid 4a là một chất
42
kém bền với ẩm, thực hiện one-pot với quá trình clor hóa-amin hóa chất 4 là hoàn toàn hợp lý.
Hình 3.19. Sự phân hủy imidoyl clorid 4a về hợp chất 4
Chất 7 (ESI-MS, MeOH): xuất hiện pic ion phân tử [M-H]- = 372,9 và [M+H]+ = 374,9 phù hợp với m/z lý thuyết [M-H]- = 373,07 và [M+H]+ = 375,10 ứng với công thức phân tử C18H16ClN4O2.
Hỗn hợp anhydrid hỗn tạp (ESI-MS, MeOH): trên phổ [M+H]+ chúng tôi quan sát thấy sự xuất hiện của pic 227,9; tương ứng với công thức phân tử C12H21NO3
m/z [M+H]+ lý thuyết = 228,16. Ngoài ra, trên phổ chúng tôi quan sát thấy pic 144,0, ứng với công thức phân tử C7H13NO2 m/z [M+H]+ lý thuyết = 144,10; chất này là kết quả của quá trình acyl hóa giữa anhydrid hỗn tạp và dung môi methanol trong quá trình đo.
Hình 3.20. Quá trình acyl hóa giữa anhydrid hỗn tạp và methanol
Trên phổ MS này còn chỉ ra pic 129,9 với cường độ nhỏ ứng với công thức C6H11NO2 với m/z [M+H]+ lý thuyết là 130,09, là sản phẩm thủy phân của anhydrid hỗn tạp hoặc có thể của tạp O2 do ảnh hưởng của dung môi (hình 3.21).
43
Hình 3.22. Phổ [M+H]+ của anhydrid hỗn tạp và các pic phân tích
Ngoài ra, qua phân tích phổ [M-H]- chúng tôi cũng quan sát thấy pic 127,9 với cường độ yếu; tương ứng với công thức phân tử C6H11NO2 với m/z [M-H]- lý thuyết là 128,07. (phụ lục 7b)
Qua phân tích ở trên cho thấy sản phẩm anhydrid hỗn tạp tạo ra là sản phẩm khá chọn lọc.
Afatinib thô (chưa tinh chế): trên hình ảnh phổ xuất hiện pic ion phân tử [M-H]-
= 483,9 và [M+H]+ = 486,0 (tương ứng lần lượt trên 2 phổ [M-H]- và [M+H]+ ) phù hợp với m/z lý thuyết [M-H]- = 484,16 và [M+H]+ = 486,17; ứng với công thức phân tử C24H25ClFN5O3. Chứng minh sự có mặt của afatinib trong dịch afatinib thô (hình 3.23). Đồng thời, phổ MS chỉ ra có sự xuất hiện của tạp chất
A1 do sự tấn công của Nucleophil- amin thơm vào gốc acyl 2-ethylbutanoyl (đã
44
Hình 3.23. Phổ [M+H]+ của dịch afatinib chưa tinh chế và pic của afatinib
Afatinib base (sau khi đã tinh chế): xuất hiện pic ion phân tử [M-H]- = 483,7 và [M+H]+ = 486,8 phù hợp với m/z lý thuyết [M-H]- = 484,16 và [M+H]+ = 486,17. Sau khi tinh chế, pic của tạp A1 không còn xuất hiện trên phổ [M+H]+ và [M-H]-
chứng tỏ quá trình tinh chế chọc lọc, thu được afatinib sạch. (Phụ lục 9a,9b)
3.3.2.2. Phổ hồng ngoại - IR
Chất 5: Phổ đồ xuất hiện các dải hấp thụ với các đỉnh đặc trưng cho từng nhóm chức, cụ thể như sau: đỉnh hấp thụ với số sóng 3607 cm-1 đặc trưng cho liên kết N-H, 3096 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-H no. Các đỉnh 1653, 1623 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=N; các đỉnh 1572, 1500, 1435 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=C thơm. Các đỉnh hấp thụ với số sóng 1544, 1364 cm-1 đặc trưng cho liên kết NO2; các đỉnh 1329, 1151 cm-1 đặc trưng cho liên kết SO2; đỉnh 1216 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-F.
Afatinib base: Trên phổ đồ afatinib xuất hiện các dải hấp thụ với các đỉnh đặc trưng cho từng nhóm chức, cụ thể: đỉnh hấp thụ ở 3493 cm-1 đặc trưng cho dao động hoá trị của liên kết N-H của amin, các đỉnh 3404, 3318 cm-1 đặc trưng cho liên kết N-H amid, đỉnh 3129 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-H thơm và các đỉnh hấp thụ 2981, 2866, 2846 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-H no. Tín hiệu C=O amid có đỉnh hấp thụ tại 1674 cm-1. Phổ đồ của afatinib xuất hiện đỉnh 1625 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=N, các đỉnh 1576, 1530, 1541, 1497 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=C. Tín hiệu C-O của cả 2 vị trí ether đều xuất hiện trên phổ với các đỉnh đặc trưng 1261, 1224 và 1086, 927 cm-1. Đỉnh 1206 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-F.
45
Afatinib dimaleat: Phổ đồ của afatinib dimaleat xuất hiện dải hấp thụ đặc trưng cho N-H, O-H ở các đỉnh 3347, 3272, 3210 cm-1. Đỉnh 3042 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-H thơm, các đỉnh 2972, 2862 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-H no. Phổ đồ xuất hiện đỉnh 2472 cm-1 đặc trưng cho liên kết N+-H do N tạo muối. Đỉnh 1685 cm- 1 đặc trưng cho liên kết C=O amid; đỉnh 1618 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=N, do tạo muối nên đỉnh hấp thụ cho liên kết C=N bị thay đổi. Các đỉnh hấp thụ 1573, 1527, 1497, 1465 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=C. Tín hiệu C-O của cả 2 vị trí ether đều xuất hiện trên phổ với các đỉnh đặc trưng 1265, 1219 và 1067, 921 cm-1.
3.3.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR, 600 MHz, DMSO
Chất 5: Trên phổ đồ có các tín hiệu đặc trưng cho các proton trong phân tử 5, trong đó có các tín hiệu singlet ở vị trí 10,43 ppm thuộc về nguyên tử H ở nhóm N-H, 9,30 ppm thuộc về H ở vị trí 5, 8,86 ppm thuộc về H ở vị trí 2. Tín hiệu doublet doublet ở 8,13 ppm thuộc về H ở vị trí 2c, do có sự tương tác với H ở 3c và Clo. Tiếp đến là tín hiệu doublet ở 7,94 ppm thuộc về 2H ở vị trí 2b và 6b. Tín hiệu multiplet ở khoảng 7,79-7,76 ppm thuộc về 2H ở vị trí 5c, 6c; khoảng 7,50- 7,45 ppm thuộc về 2H ở vị trí 3b, 5b. Cuối cùng là tín hiệu singlet ở vị trí 2,42 ppm thuộc về 3H trên nhóm CH3 ở vị trí 7b.
Afatinib dạng base: trên phổ đồ có các tín hiệu đặc trưng cho các proton trong phân tử afatinib, cụ thể như sau: có các tín hiệu singlet ở vị trí 9,78 ppm thuộc về H gắn với N amid, vị trí 9,43 ppm thuộc về H gắn với N amin, 8,95 ppm thuộc về H ở vị trí 2, 8,51 ppm thuộc về H ở vị trí 5. Tiếp theo là tín hiệu doublet doublet ở vị trí 8,11 ppm thuộc về H ở vị trí 8. Tín hiệu multiplet ở khoảng 7,81- 7,78 ppm thuộc về H ở vị trí 6c. Tiếp đến là tín hiệu triplet ở 7,39 ppm thuộc về H ở vị trí 5c. Tín hiệu singlet ở 7,21 ppm thuộc về H ở 2c. Tín hiệu doublet triplet ở 6,81 ppm thuộc về H ở vị trí 3d với J = 15,0. Tín hiệu doublet ở 6,59 ppm và hằng số tương tác J=15,0 là tín hiệu thuộc về H ở vị trí 2d. Hai tín hiệu ở 2 vị trí 2d, 3d như vậy với 2 hằng số tương tác J đều bằng 15,0 chứng minh cấu hình E được bảo đảm. Tiếp theo là tín hiệu singlet tù ở vị trí 5,26 ppm thuộc về H ở vị trí 1b. Tín hiệu multiplet ở khoảng 4,01-3,97 ppm thuộc về 2H ở vị trí 4b; khoảng 3,94-3,90 ppm và khoảng 3,79-3,75 ppm thuộc về 2H ở vị trí 2b. Tín hiệu doublet 3,08 ppm thuộc về H ở vị trí 4d. Tín hiệu của 2H ở vị trí 5b là tín hiệu sextet ở vị
46
trí 2,33 ppm và vị trí 2,16 ppm. 6H của –CH3 ở vị trí 6d và 7d được đặc trưng bởi tín hiệu singlet ở vị trí 2,17 ppm.
Afatinib dimaleat: 10,00 (1H, br.s, H-amid); 9,76 (1H, s, H (amin N-H)); 8,94 (1H, s, H-5); 8,58 (1H, s, H-2); 8,10 (1H, dd, J1 = 2,1 Hz, J2 = 6,6 Hz, H-2c); 7,79-7,76 (1H, m, H-6c); 7,44 (1H, dd, J1 = J2 =9,0 Hz, H-5c); 7,27 (1H, s, H- 8); 6,80-6,76 (2H, m, H-2d, H-3d); 6,14 (4H, s, H-2e, H-3e); 5,31 (1H, s, H- 1b); 4,00-3,91 (4H, m, H-4d, H-4b); 3,93 (1H, dd, J1 = J2 =7,8, H-2b); 3,80- 3,77 (1H, m, H-2b); 2,83 (6H, s, H-6d, H-7d); 2,37 (1H, ddd, J1 = J2 = J3= 6,6 Hz, H-5b); 2,13 (1H, p, J =6,6 Hz, H-5b).
Phổ đồ có các tín hiệu đặc trưng cho các proton trong phân tử afatinib dimaleat, cụ thể như sau: có các tín hiệu singlet tù ở vị trí 10,00 ppm thuộc về H gắn với N amid, vị trí 9,76 ppm thuộc về H gắn với N amin, 8,94 ppm thuộc về H ở vị trí 5, 8,58 ppm thuộc về H ở vị trí 2. Tiếp theo là tín hiệu doublet doublet ở vị trí 8,10 ppm thuộc về H ở vị trí 2c. Tín hiệu multiplet ở khoảng 7,79-7,76 ppm thuộc về H ở vị trí 6c. Tiếp đến là tín hiệu doublet doublet ở 7,44 ppm với J1=J2=9,0 Hz thuộc về H ở vị trí 5c. Tín hiệu singlet ở 7,27 ppm thuộc về H ở vị trí 8. 2 H ở vị trí 2d, 3d được thể hiện ở tín hiệu multiplet trong khoảng 6,80-6,76 ppm. Tín hiệu singlet ở 6,14 ppm thuộc về 4 H ở vị trí 2e, 3e; 5,31 ppm thuộc về H ở vị trí 1b. Tín hiệu multiplet trong khoảng 4,00-3,91 ppm thuộc về 4 H ở vị trí 4d, 4b. 2 H ở vị trí 2b được đặc trưng bởi 2 tín hiệu là tín hiệu doublet doublet ở vị trí 3,93 ppm và tín hiệu multiplet ở khoảng 3,80-3,77 ppm. Tiếp theo, tín hiệu singlet ở 2,83 ppm thuộc về 6 H ở vị trí 6d, 7d. Cuối cùng là tín hiệu doublet doublet doublet ở vị trí 2,37 ppm và tín hiệu pentet 2,13 ppm với 2 J đều bằng 6,6 Hz thuộc về H ở vị trí 5b.
3.3.2.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13C-NMR, 150 MHz, DMSO
Chất 5: Phổ đồ xuất hiện các tín hiệu tương ứng với các nguyên tử carbon trong phân tử 5. Ngoài ra, ở nhánh amin, vòng benzen có nguyên tử F khiến các nguyên tử Carbon trong vòng này dễ dàng tách pic. Cụ thể tín hiệu của C ở vị trí 4c tách thành 2 pic 154,79 ppm và 153,17 ppm, tương ứng với hằng số J = 243,0 (so với
1JCF = 245,1). Các pic 128,17 ppm và 128,01 ppm thuộc về C ở vị trí 3c do có hằng số J là 24,0 (so với giá trị lí thuyết 2JCF = 21,0), 116,88 ppm và 116,73 ppm thuộc về C ở vị trí 5c do có hằng số J là 22,5 (so với giá trị lí thuyết 2JCF = 21,0).
47
Các pic 122,89 ppm và 122,85 ppm thuộc về C-2c do có hằng số J là 6,0 (so với giá trị lí thuyết 3JCF = 7,8), 116,88 ppm và 116,73 ppm thuộc về C-6c do có hằng số J là 22,5 (so với giá trị lí thuyết 2JCF = 21,0).
Afatinib: Phổ đồ xuất hiện các tín hiệu tương ứng với các nguyên tử carbon trong
phân tử afatinib. Nguyên tử Flo tại vòng benzen của nhánh amin khiến các nguyên tử Carbon ở vòng thơm này dễ tách thành các pic. Trong đó xuất hiện pic 153,98 và 152,37 ppm tương ứng với C ở vị trí 4c, có hằng số J = 241,5 (so với
1JCF = 245,1). Các pic 136,81 ppm và 136,80 ppm thuộc về C ở vị trí 1c do có hằng số J là 1,5 (so với giá trị lí thuyết 4JCF = 3,2). Pic 122,37 và 122,33 thuộc về C ở vị trí 6c do có hằng số J là 6,0 (so với giá trị lí thuyết 3JCF = 7,8). Pic 118,77 và 118,65 thuộc về C ở vị trí 3c do có hằng số J là 18,0 (so với giá trị lí thuyết 2JCF = 21,0); pic 116,44 và 116,30 thuộc về C ở vị trí 5c do có hằng số J là 21,0 (so với giá trị lí thuyết 2JCF = 21,0).
Các hằng số J lý thuyết được tham khảo tại tài liệu [16]