L ỜI CẢM ƠN
3.3.2. Quy trình nghiên cứu sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương cô đặc
Dựa vào các trang thiết bị có sẵn tại Viện Khoa học Sự sống – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, quy trình sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương cô đặc và protein thủy phân được nghiên cứu xây dựng như sau:
Bước 1: Tiến hành ngâm đậu tương ở các mức thời gian khác nhau: 4h, 7h, 10h, 12h. Lượng nước ngâm là 250ml/100g đậu, nhiệt độ phòng.
Bước 2: Đậu tương đã ngấm nước, tiến hành loại bỏ vỏ hạt bằng cách chà xát thủ công sau đó nhúng vào nước. Lớp vỏ đậu tương sau khi tách sẽ nổi trên mặt nước, dùng tay hoặc rổ hớt bỏ hoàn toàn phần vỏ ra khỏi hạt đậu tương.
Bước 3: Tiếp theo sau khi tách vỏ, hạt đậu tương được cho vào máy và cho thêm nước để xay nhỏ mục đích để phá vỡ hạt và giải phóng protein. Giai đoạn này có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tách protein, đồng thời dùng nước hòa tan các chất đểthu được dung dịch “sữa đậu”, thời gian xay khoảng 3 – 5 phút.
20
Bước 4: Sau khi xay, thu được hỗn hợp đậu tương gồm có dịch sữa đậu tương và những chất rắn không tan trong nước. Lọc ít nhất 2 lần để có thể thu được phần dịch sữa đậu nhiều nhất và loại hoàn toàn phần bã ra khỏi dung dịch sữa đậu tương.
Bước 5: Sau khi thu được dịch lỏng, tiến hành ly tâm lạnh 14000 vòng trong 30 phút. Ly tâm bỏ dịch nổi thu cặn và sử dụng phương pháp sấy thăng hoa để sấy khô.
Bước 6: Dùng phương pháp sấy thăng hoa để tạo ra được sản phẩm dạng bột mịn, thời gian bảo quản lâu.
3.3.3.Quy trình sản xuất bột protein đậu tương thủy phân
Nguyên liệu: Chuẩn bị nguyên liệu sạch tạp chất. Quá trình sản xuất bột protein thủy phân gồm các công đoạn sau:
Công đoạn 1: Tiến hành ngâm đậu tương ở các mức thời gian khác nhau: 4h, 7h, 10h, 12h. Lượng nước ngâm là 250ml/100g đậu, nhiệt độ nước ngâm là 15 – 20˚C (nhiệt độ phòng).
Công đoạn 2: Đậu tương sau khi ngâm được loại bỏ vỏ hạt bằng cách chà xát thủcông và nhúng vào nước. Lớp vỏđậu tương sau khi tách sẽ nổi trên mặt nước, dùng tay hoặc rổ hớt bỏ hoàn toàn phần vỏ ra khỏi hạt đậu tương.
Công đoạn 3: Tiếp theo sau khi tách vỏ, hạt đậu tương được cho vào máy và cho thêm nước để xay nhỏ nhằm giải phóng protein, đồng thời dùng nước hòa tan các chất để thu được dung dịch sữa đậu, xay trong thời gian khoảng 3 – 5 phút.
Công đoạn 4: Hỗn hợp đậu tương sau khi xây gồm có hai thành phần: Dịch sữa đậu tương và những chất rắn không tan trong nước. Lọc ít nhất 2 lần
21
để có thể thu được phần dịch sữa đậu nhiều nhất và loại hoàn toàn phần bã ra khỏi dung dịch sữa đậu tương.
Công đoạn 5: Để thu nhận protein trong dịch sữa đậu, dùng axit HCl để tủa protein hòa tan trong dung dịch. Với sự có mặt của HCl, pH của dung dịch được đưa về 4,5 là pH đẳng điện của protein globulin. Nhiệt độ kết tủa ở 45˚C với các mức thời gian khác nhau 1h, 2h, 3h. Sau khi tủa rửa lại bằng nước để loại bỏ một phần axit ra khỏi dịch thủy phân protein.
Công đoạn 6: Dùng NaOH đểtrung hòa đưa pH về 7 – 9
Công đoạn 7: Sử dụng máy ly tâm lạnh để ly tâm thu protein bỏ phần dịch trên, ly tâm 14000 vòng trong thời gian 30 phút.
Công đoạn 8: Sử dụng máy sấy lạnh để sấy với nhiệt độ - 60˚C, áp suất 120mmTorr trong 10h đến 16h.
3.3.4.Định lượng protein tổngsố bằng phương pháp Kjeldahl
Trong phương pháp Kjeldahl, mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 98%, kết hợp với chất xúc tác để chuyển Nitơ hữu cơ ra dạng vô cơ (NH4)2SO4, rồi dùng NaOH để đẩy NH3 ra khỏi muối amoni. Các phân tử NH3 sau khi được giải phóng ra sẽđược cuốn đi bằng dòng hơi nóng. Sau khi được làm nguội sẽ hấp thụ vào dung dịch H3BO3 ở trong bình hứng tạo ra muối borat amon có mầu xanh trong.
Để xác định lượng ammoniac (NH3) giải phóng ra trong quá trình chưng cất, tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1N đến khi nào dung dịch chuyển sang màu tím nhạt. Dư lượng axit H2SO4 0,1N tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ cho phép tính được lượng protein có trong mẫu.
Thuốc thử và vật liệu:
22
+ Chất xúc tác, (Viên xúc tác Kjeltao ST và Kjeltab CM của hang Gerhardt)
+ Hydroxit natri, (NaOH) 33% + Chất chỉ thị màu Tashiro + Axit Boric (H3BO3) 4% + Axit sunfuric (H2SO4) 0,1N + Nước cất
+ Chất chuẩn
Dụng cụ và thiết bị
Hệ thống phân tích Nitơ bao gồm: Bộ công phá mẫu Turbortherm – Gerhardt và hệ thống chưng cất mẫu Vapodest 40 – Gerhardt, tủ hút có hệ thống thông gió, máy khuấy từ, Buvet điện tử, cân phân tích điện tử với độ chính xác 0,0001, ống công phá mẫu Kjeldahl 250ml.
Kết quả
Để có thể biết được hàm lượng protein tổng số ta tính toán theo công thức
X= Trong đó:
X: là lượng protein có trong mẫu
V: là lượng H2SO4 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ cho mẫu phân tích (ml) V1: là lượng H2SO4 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ cho mẫu trắng (ml) f: là hệ số chuẩn độ a xít (hệ số sử dụng dung dịch)
0,0014: là lượng Nitơ tương ứng với 1ml dung dịch a xít sulphuaric 0,1N
m: là khối lượng mẫu (g)
Chúng ta biết rằng trong chất đạm có chứa khoảng 16% N, vì vậy việc tính toàn lượng đạm hàm lượng N thường được dùng hệ số 100/16 = 6,25.
V – V1 × f × 0,0014 x 6,25 × 100
23
3.3.5. Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry
Nguyên tắc:
Dựa vào cường độ màu xanh của phức đòng chất, protein khử hỗn hợp Phosphomolipdate – phosphovonphramate (thuốc thử Foling – Ciocalteau). Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng protein.[5]
Lập đồ thị chuẩn định lượng protein:
Nguyên liệu và hóa chất: Albumin tiêu chuẩn 100%.
Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N
Dung dịch B : CuSO4 0,5% trong Natri, kali tactrate 1N Dung dịch C : 49 ml dung dịch A: 1 ml dung dịch B Thuốc thử Folling.
Pha dung dịch albumin 0,02% từ albumin gốc tinh khiết 100%. Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6, cho các chất tham gia phản ứng trong bảng 3.1. Sau đó đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 660nm.
Bảng 3.3. Xây dựng đường chuẩn định lượng protein theo Lowry Các ống nghiệm Hóa chất 1 2 3 4 5 6 Protein 0,02% 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Nước cất (ml) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Lượng protein (ml) 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 Dung dịch C (ml) 4 4 4 4 4 4 Thuốc thử Follin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Kết quảđo OD ở 660 nm 0,00 0,091 0,182 0,252 0,332 0,377
24
-Cách tiến hành:
+ Mẫu thí nghiệm: Lấy 0,5 ml dung dịch đậu tương, thêm vào 0,5ml H2O và 4 ml dung dịch C, lắc đều và giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút. Sau đó thêm chính xác 0,5 ml thuốc thử Follin nồng độ 1N, lắc đều, để 30 phút sau đó đem so màu trên máy với bước sóng 660nm.
+ Từ số đọc của mẫu thí nghiệm, đối chiếu với đồ thị để tính ra hàm lượng protein có trong mẫu.
+ Mẫu đối chứng: Song song với mẫu thí nghiệm, làm ống đối chứng trong đó thay dung dịch protein bằng nước cất và tiếp tục làm như mẫu thí nghiệm.
Bảng 3.4. Kết quả đo sự ảnh hưởng của thời gian ngâm đến hàm lượng protein Thí nghiệm (T/g) Hóa chất Đ/c 4h 7h 10h 12h Dd protein mẫu(ml) 0 0,5 0,5 0,5 0,5 Nước cất (ml) 1 0,5 0,5 0,5 0,5 Dd C (ml) 4 4 4 4 4 Dd folin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Kết quả OD ở 660nm 0,00 0,0157 0,016 0,0159 0,058
3.3.6.Phương pháp điện di SDS – PAGE để đánh giá mức độ thủy phân của
protein
SDS-PAGE phân tách protein theo trọng lượng phân tử của chúng, dựa trên tốc độ di chuyển chênh lệch của chúng (gel) dưới tác động của điện trường. Các bước của phương pháp điện di được tiến hành như sau:
25
Bảng 3.5: Thành phần dung dịch pha gel SDS - PAGE
Seperating Gel Stacking Gel
7.5% 10% 12.5% 15% 17.5% 20% 4%
Monomer 2ml 2.67ml 3.34ml 4ml 4.67ml 5.34ml 0.67ml 4☓resolving gel buffer
2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 1.25ml Water 3.86ml 3.19ml 2.53ml 1.86ml 1.19ml 5.25ml 3ml 10% SDS 80μl 80μl 80μl 80μl 80μl 80μl 50μl 10% APS 60μl 60μl 60μl 60μl 60μl 60μl 25μl
TEMED 4μl 4μl 4μl 4μl 4μl 4μl 5μl Chuẩn bị gel Seperating 12.5% và Stacking 4%:
- Các bước tiến hành:
+ Chuẩn bị dung dịch
+ Lau sạch 2 tấm kính làm khuôn gel và miếng đệm + Rót dung dịch gel vào giữa 2 tấm kính rồi gắn lược vào + Để trong nhiệt độ phòng trong 30 phút
+ Rút lược, tháo băng, gắn khuôn gel vào buồng điện di
+ Đổ dung dịch đệm Running buffer 1x vào bể điện di đủ để ngập hết bản gel.
- Tra mẫu điện di:
+ Sử dụng Loading Buffer => tỉ lệ mẫu được pha trộn là 20µl mẫu + 5µl loading buffer rồi để 100˚C trong 5 phút.
26
Step1: 50V, 100mA, 15W trong 30 phút
Step2: 100V, 200mA, 30W trong 1 giờ 30 phút - Nhuộm gel với dung dịch Coomassie Blue Stain:
+ Bản gel được lấy ra khỏi bể điện di sau khi điện di xong và được nhuộm qua đêm.
+ Rửa gel bằng dung dịch Isopropanol Fixing Solution + Kiểm tra kết quả điện di và chụp ảnh bản gel.
27
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN