- Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC).
- Sau khi triển khai sắc ký, hiện vết sắc ký đồ và chụp ảnh ở bƣớc sóng 254 nm để quan sát cả 3 vết: B1, B6, B12; ở bƣớc sóng 366 nm để bán định lƣợng vitamin B1, B6 và ở ánh sáng khả kiến để bán định lƣợng vitamin B12.
- Ảnh chụp sắc ký đồ đƣợc chuyển sang xử lý bằng phần mềm VideoScan. Phần mềm này sẽ dựa trên hình ảnh sắc ký đồ vừa đƣợc chụp để ghi lại thành các pic và tính toán diện tích pic (hoặc chiều cao) tƣơng ứng.
C t + c – C t
×100% C c
- Phƣơng pháp xử lý kết quả: giá trị trung bình, độ lệch chuẩn tƣơng đối, phƣơng trình hồi quy, hệ số tƣơng quan xác định bằng phần mềm Microsoft Office Excel.
- Nồng độ B1, B6, B12 trong mẫu thử đƣợc xác định dựa vào phƣơng trình hồi quy biểu diễn mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ B1, B6, B12 trong mẫu chuẩn đƣợc xây dựng trong mỗi lần phân tích.
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. 3.1. Chuẩn bị mẫu trắng, dung dịch chuẩn và thử.
3.1.1. Pha mẫu trắng và dung dịch chuẩn gốc
- Mẫu trắng: lấy 1 nang mềm KO-GINSZHI, bỏ vỏ nang, hòa tan trong 2 ml chloroform rồi thêm EtOH thành khoảng 10 ml, đem siêu âm trong 5 phút. Để yên 20 phút, sau đó ly tâm lấy dịch làm mẫu trắng.
- Chuẩn gốc B1: Cân chính xác khoảng 125 mg thiamin hydroclorid vào bình định mức dung tích 50 ml, thêm 10,0 ml nƣớc cất, lắc đều rồi đem siêu âm trong 5 phút cho tan hoàn toàn. Sau đó pha loãng bằng EtOH tới vạch định mức, lắc đều ta đƣợc dung dịch chuẩn gốc B1 có nồng độ khoảng 2,5 mg/ml.
- Chuẩn gốc B6: Cân chính xác khoảng 100 mg pyridoxin hydroclorid vào bình định mức dung tích 50 ml, thêm 10,0 ml nƣớc cất, lắc đều rồi đem siêu âm trong 5 phút cho tan hoàn toàn. Sau đó thêm EtOH tới vạch định mức, lắc đều ta đƣợc dung dịch chuẩn gốc B6 có nồng độ khoảng 2 mg/ml.
- Chuẩn gốc B12: Cân khoảng 25 mg cyanocobalamin vào bình định mức dung tích 50 ml, thêm 10,0 ml nƣớc cất, lắc đều rồi đem siêu âm trong 5 phút cho tan hoàn toàn. Thêm EtOH tới vạch, lắc đều đƣợc dung dịch chuẩn gốc B12 có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml. Do B12 rất dễ hút ẩm và dễ phân hủy, lại đƣợc cân với lƣợng nhỏ, nên để giảm sai số trong quá trình cân, nồng độ B12 đƣợc xác định lại bằng phƣơng pháp đo quang ở bƣớc sóng 361 nm, E (1%, 1cm) ở bƣớc sóng này là 207 [4].
3.1.2. Pha dung dịch chuẩn
- Chuẩn hỗn hợp B1, B6, B12: Lấy 2,0 ml dung dịch chuẩn gốc B1, 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc B6, 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc B12, 0,2 ml nƣớc cất cho vào bình định mức dung tích 10 ml, thêm EtOH tới vạch, lắc đều thu đƣợc
dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ B1 khoảng 0,5 mg/ml, B6 khoảng 1 mg/ml, B12 khoảng 0,05 mg/ml.
- Mẫu trắng có thêm vitamin B1: dùng pipet chia vạch lấy 0,2 ml dung dịch chuẩn gốc B1 và 0,8 ml mẫu trắng cho vào ống nghiệm nhỏ, lắc đều.
- Mẫu trắng có thêm vitamin B6: lấy 0,5 ml dung dịch chuẩn gốc B6 và 0,5 ml mẫu trắng cho vào ống nghiệm nhỏ, lắc đều.
- Mẫu trắng có thêm vitamin B12: lấy 0,1 ml dung dịch chuẩn gốc B12 và 0,9 ml mẫu trắng cho vào ống nghiệm nhỏ, lắc đều.
- Mẫu trắng có thêm B1, B6 và B12: lấy 0,5 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp và 0,5 ml mẫu trắng cho vào ống nghiệm nhỏ, lắc đều.
3.1.3. Pha dung dịch thử
- Cân chính xác 20 viên chế phẩm, xác định khối lƣợng trung bình của 1 viên, nghiền mịn.
- Dung dịch thử 1 (bán định lƣợng B1 và B6): cân chính xác một lƣợng bột viên tƣơng ứng với 50 mg B1 vào bình định mức dung tích 100 ml, thêm 20,0 ml nƣớc cất, lắc đều, đem siêu âm trong 5 phút, sau đó thêm EtOH tới vạch, lắc đều. Lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu, lấy dịch lọc sau.
- Dung dịch thử 2 (bán định lƣợng B12): cân chính xác một lƣợng bột viên tƣơng ứng với 200 µg B12 vào ống nghiệm, thêm 5,0 ml hỗn hợp gồm EtOH – H2O (4:1), lắc đều, đem siêu âm trong 5 phút, sau đó đem ly tâm lấy dịch.
3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký
Bản mỏng sử dụng là HPTLC silica gel 60 F254 (MERCK).
3.2.1. Khảo sát thành phần pha động
1.EtOH – chloroform – aceton – amoniac, 2:2:2:1.
2.EtOH – chloroform – acid acetic – amoniac – nƣớc, 6:5:5:1:1.
- Mẫu đƣa lên bản mỏng là dung dịch chuẩn hỗn hợp có chứa 3 vitamin B1, B6, B12. Hiện vết sắc ký dƣới đèn UV – VIS ở bƣớc sóng 254 nm, 366 nm và ánh sáng khả kiến, kết quả thu đƣợc ở hình 3.1 và 3.2:
Hình 3.2: Sắc ký đồ khi triển khai bằng pha động 1
a b c a b c a: Quan sát dƣới ánh sáng khả kiến. b: Quan sát dƣới bƣớc sóng 254 nm. c: Quan sát dƣới bƣớc sóng 366 nm a: Quan sát dƣới ánh sáng khả kiến. b: Quan sát dƣới bƣớc sóng 254 nm. c: Quan sát dƣới bƣớc sóng 366 nm
- Nhận xét: Sắc ký đồ thu đƣợc khi triển khai bằng pha động 1 có B1 bị kéo vết, vết B12 có Rf quá thấp. Pha động 2 cho sắc ký đồ gọn, tách tốt, hệ số lƣu giữ Rf của các vết thích hợp. Do đó, chúng tôi chọn hệ dung môi này cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2. Lựa chọn bƣớc sóng phát hiện
- Khi quan sát sắc ký đồ ở bƣớc sóng 254 nm có thể phát hiện đƣợc cả 3 thành phần B1, B6, B12, tuy nhiên khóa luận chọn ánh sáng khả kiến để bán định lƣợng B12 và chọn bƣớc sóng 366 nm để bán định lƣợng B1, B6 vì các lý do sau:
Do hàm lƣợng B12 quá chênh lệch với B1, B6 nên việc định lƣợng đồng thời cả 3 thành phần ở bƣớc sóng 254 nm là không khả thi.
Dƣới ánh sáng khả kiến chỉ quan sát thấy vết B12, bán định lƣợng B12 ở ánh sáng này sẽ loại đƣợc ảnh hƣởng bởi các vết khác (vết B1, B6 ở nồng độ đậm đặc trong dung dịch thử, vết tá dƣợc) thấy đƣợc khi soi dƣới đèn UV – VIS bƣớc sóng 254 hoặc 366 nm.
Khi đã bán định lƣợng riêng B12 ở ánh sáng khả kiến thì B1, B6 có thể bán định lƣợng ở bƣớc sóng 366 để dễ quan sát và không làm rối sắc ký đồ bởi vết B12.
3.2.3. Khảo sát thể tích dung dịch mẫu đƣa lên bản mỏng và các điều kiện sắc ký khác. sắc ký khác.
Khảo sát qua nhiều lần thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy các thông số sau là thích hợp để sắc ký đồ tách vết hoàn toàn, rõ nét, pic thu đƣợc đẹp, cân đối, hệ số Rf nằm trong khoảng tin cậy:
- Hoạt hóa bản mỏng: ở 100oC trong 30 phút.
- Độ rộng vết mẫu khi chấm: 4 – 5 mm.
- Khoảng cách từ vết mẫu đầu tiên đến mép bên của bản mỏng tối thiểu 1 cm để tránh hiệu ứng bờ, khoảng cách từ đƣờng xuất phát đến cạnh dƣới của bản mỏng là 1cm, quãng đƣờng pha động chạy tính từ điểm xuất phát là 7 cm.
- Tốc độ phun mẫu tự động là 30 nl/s.
- Nhiệt độ phân tích: 20 – 25oC.
Nhƣ vậy, điều kiện tối ƣu để bán định lƣợng 3 thành phần B1, B6, B12 là:
- Bản mỏng HPTLC silica gel 60 F254 (MERCK), hoạt hóa ở 100oC trong 30 phút.
- Pha động: EtOH – chloroform – acid acetic – amoniac – nƣớc, 6:5:5:1:1.
- Thể tích mẫu đƣa lên bản mỏng: 4 – 5µl.
- Độ rộng vết chấm, vị trí vết chấm: nhƣ hình 3.3.
- Tốc độ phun mẫu tự động là 30 nl/s.
- Nhiệt độ phân tích: 20 – 25oC.
- Phát hiện vết: vết B1, B6 phát hiện ở bƣớc sóng 366 nm, vết B12 phát hiện ở ánh sáng khả kiến. - Xử lý kết quả: bằng phần mềm VideoScan. 7 cm 1 cm 1cm 0,5 cm
Tuyến dung môi
Vết mẫu chấm
Hình 3.3: Vị trí chấm mẫu trên bản mỏng HPTLC silica gel 60 F254 kích thước 20 x 10 cm
3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích 3.3.1. Bán định lƣợng B1 và B6 3.3.1. Bán định lƣợng B1 và B6
3.3.1.1. Độ đặc hiệu – chọn lọc
- Trên một bản mỏng chấm 5 vết: mẫu trắng, mẫu trắng có thêm B1, mẫu trắng có thêm B6, mẫu trắng có thêm B12 và mẫu trắng có thêm cả B1, B6, B12.
- Khai triển sắc ký với các điều kiện tối ƣu đã khảo sát ở trên.
- Sau khi khai triển, quan sát sắc ký đồ ở bƣớc sóng 366 nm, kết quả thu đƣợc ở hình 3.4:
Nhận xét: Kết quả thực nghiệm cho thấy: - Các vết trên sắc ký đồ tách rời nhau.
1. Mẫu trắng
2. Mẫu trắng có thêm vitamin B1 3. Mẫu trắng có thêm vitamin B6 4. Mẫu trắng có thêm vitamin B12 5. Mẫu trắng có thêm B1, B6, B12
Hình 3.4: Sắc ký đồ thử độ đặc hiệu – B1, B6 khi soi dưới đèn UV ở bước sóng 366 nm.
B 6
- Mẫu trắng có thêm B1 hoặc B6 xuất hiện lần lƣợt 2 vết tƣơng ứng với các vitamin này, có Rf = 0,38 và 0,65. Mẫu trắng chứa B1, B6 và B12 xuất hiện cả 2 vết tƣơng ứng với 2 vitamin B1, B6, riêng B12 không quan sát thấy ở bƣớc sóng này. Các vết B1, B6 đều tách nhau và không trùng với vết nào của mẫu trắng.
Kết luận: phƣơng pháp có tính đặc hiệu – chọn lọc đối với B1 và B6 .
3.3.1.2. Đƣờng chuẩn – khoảng tuyến tính.
- Thiết lập đƣờng chuẩn: Chấm 5 vết dung dịch chuẩn hỗn hợp với thể tích mẫu đƣa lên bản mỏng lần lƣợt từ 3 – 7 µl. Sấy cho dung môi pha mẫu bay hơi hết, sau đó tiến hành sắc ký ở điều kiện đã chọn.
- Hiện vết vitamin B1 và B6 ở bức xạ 366nm, xử lý ảnh chụp bằng phần mềm VideoScan. Kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.5 và bảng 3.1.
B1
B6
Hình 3.5: Sắc ký đồ 1 vết của đường chuẩn B1 và B6 thu được với phần mềm VideoScan
Bảng 3.1: Kết quả phân tích vitamin B1 và B6 trên dãy dung dịch chuẩn Thể tích dung dịch chuẩn (µl) Vitamin B1 Vitamin B6 Nồng độ tƣơng ứng (mg/ml) Diện tích pic (mAU) Nồng độ tƣơng ứng (mg/ml) Diện tích pic (mAU) 3 0,3046 8935 0,6342 58708 4 0,4061 15734 0,8456 77815 5 0,5076 21951 1,0570 92653 6 0,6091 27174 1,2684 103643 7 0,7106 32273 1,4798 113425
- Thiết lập đƣờng chuẩn vitamin B1 và B6 dựa trên kết quả thu đƣợc (hình 3.6 và 3.7): y = 57257x - 7850 r = 0.995 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 Di ệ n t íc h p íc (m A U) Nồng độ(mg/ml)
Đường chuẩn vitamin B1
- Kết quả cho thấy đƣờng chuẩn dung dịch vitamin B1 và B6 tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát với hệ số tƣơng quan (r) lần lƣợt là 0,995 và 0,980. Nhƣ vậy, khoảng nồng độ khảo sát là phù hợp để bán định lƣợng các vitamin B1, B6 trong hỗn hợp vitamin.
3.3.1.3. Độ lặp lại và độ đúng.
- Thiết kế thí nghiệm trên một bản mỏng (hình 3.7):
Xây dựng đƣờng chuẩn: 5 vết dung dịch chuẩn hỗn hợp (vết số 1 – 5). Đánh giá độ lặp lại: 6 vết dung dịch thử: T1 – T6 (vết số 6 – 11).
Đánh giá độ đúng: 6 vết dung dịch thử có thêm chuẩn hỗn hợp theo tỷ lệ 1:1 về thể tích: T1+C – T6+C (vết số 12 – 17).
- Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.8 và bảng 3.2:
y = 63984x + 21618 r = 0.980 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 Diện tích píc ( m AU) Nồng độ (mg/ml) Đƣờng chuẩn vitamin B6
Xây dựng đƣờng chuẩn Đánh giá độ lặp lại Đánh giá độ đúng
Hình 3.8: Sắc ký đồ đánh giá độ lặp lại và độ đúng – B1, B6 ở bước sóng 366 nm
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ lặp lại – B1, B6
Mẫu Vitamin B1 Vitamin B6 Diện tích pic (mAU) Nồng độ(*) (mg/ml) Diện tích pic (mAU) Nồng độ(*) (mg/ml) T1 19075 0,4801 85516 1,0198 T2 21111 0,5109 87799 1,0446 T3 20943 0,5027 87333 1,0267 T4 20224 0,4805 87127 1,0034 T5 19231 0,4709 85922 1,0007 T6 19342 0,4986 87032 1,0734 TB 0,4906 1,0281 RSD (%) 3,19 2,43
Nhận xét: độ lệch chuẩn tƣơng đối của phƣơng pháp bán định lƣợng vitamin B1 = 3,19 ≈ 3; riêng áp dụng phân tích vitamin B6 có độ lặp lại cao với RSD = 2,43 < 3. Nhƣ vậy phƣơng pháp bán định lƣợng các vitamin B1, B6
trong hỗn hợp bằng HPTLC có độ lặp lại khá cao.
- Kết quả khảo sát độ đúng của phƣơng pháp đƣợc trình bày trong bảng 3.3: Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ đúng – B1, B6 Mẫu Vitamin B1 Vitamin B6 Diện tích pic (mAU) Nồng độ chuẩn (C) tìm lại (mg/ml) Độ đúng( **) (%) Diện tích pic (mAU) Nồng độ chuẩn (C) tìm lại (mg/ml) Độ đúng( **) (%) T1 + C 19655 0,4905 96,6 87807 1,0703 101,3 T2+ C 20223 0,4748 93,5 89706 1,0939 103,5 T3+ C 20460 0,4860 95,8 89830 1,1051 104,6 T4+ C 20043 0,4840 95,4 87826 1,0457 98,9 T5+ C 20631 0,5219 102,8 87248 1,0464 99,0 T6+ C 20289 0,5080 100,1 89558 1,1013 104,2 TB 97,4 101,9 (
**): So với nồng độ thực đã biết của chuẩn (hệ số thu hồi).
- Độ đúng của phƣơng pháp khi bán định lƣợng vitamin B1 nằm trong khoảng 93,5% đến 102,8%.
- Độ đúng của phƣơng pháp khi bán định lƣợng vitamin B6 nằm trong khoảng 98,9% đến 104,6%.
Nhƣ vậy độ đúng của phƣơng pháp bán định lƣợng khi phân tích các vitamin B1, B6 trong hỗn hợp đều nằm trong khoảng giới hạn 92 – 105%, là độ đúng chấp nhận của AOAC đối với một phƣơng pháp định lƣợng ở khoảng nồng độ chất phân tích ≥ 1% (tƣơng ứng nồng độ ≥ 0,1 mg/ml) [9].
3.3.2. Bán định lƣợng B123.3.2.1. Độ đặc hiệu – chọn lọc 3.3.2.1. Độ đặc hiệu – chọn lọc
Quan sát sắc ký đồ sau khi triển khai một bản mỏng có 5 vết: mẫu trắng, mẫu trắng có thêm B1, mẫu trắng có thêm B6, mẫu trắng có thêm B12 và mẫu trắng có thêm cả B1, B6, B12 (là sắc ký đồ dùng để xác định độ đặc hiệu của phƣơng pháp khi bán định lƣợng B1, B6) ở ánh sáng khả kiến (hình 3.9):
Hình 3.9: Sắc ký đồ thử độ đặc hiệu - B12 khi quan sát dưới ánh sáng khả kiến.
1. Mẫu trắng
2. Mẫu trắng có thêm vitamin B1 3. Mẫu trắng có thêm vitamin B6 4. Mẫu trắng có thêm vitamin B12 5. Mẫu trắng có thêm B1, B6, B12
Nhận xét: Trên sắc ký đồ xuất hiện 2 vết màu hồng của B12 có Rf = 0,56 ở mẫu trắng thêm B12 và mẫu trắng thêm cả 3 vitamin, các mẫu còn lại không xuất hiện vết này. Vậy phƣơng pháp bán định lƣợng ở ánh sáng khả kiến là chọn lọc với vitamin B12.
3.3.2.2. Đƣờng chuẩn – khoảng tuyến tính
- Thiết lập đƣờng chuẩn: Chấm 5 vết dung dịch chuẩn hỗn hợp với thể tích mẫu đƣa lên bản mỏng lần lƣợt từ 3 – 7 µl. Sấy cho dung môi pha mẫu bay hơi hết, sau đó tiến hành sắc ký ở điều kiện đã chọn.
- Hiện vết vitamin B12 ở ánh sáng khả kiến, xử lý ảnh chụp bằng phần mềm VideoScan. Kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.10 và bảng 3.4.
Hình 3.10: Sắc ký đồ 1 vết của đường chuẩn B12 thu được với phần mềm VideoScan
Bảng 3.4: Kết quả phân tích vitamin B12 trên dãy dung dịch chuẩn Thể tích dd chuẩn (µl) Nồng độ tƣơng ứng (mg/ml) Diện tích píc (mAU) 3 0,0283 12440 4 0,0377 14561 5 0,0417 16570 6 0,0500 18850 7 0,0584 20610