2. Tổng quan tình hình mắc bệnh trong và ngoài nƣớc
2.3. Tình hình mắc bệnh trong nước
Tại Việt Nam, cùng với sự tăng trưởng của nền kinh tế xã hội, tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ trong 10 năm qua có xu hướng gia tăng[4]. Bệnh viện Nội tiết Trung ương thực hiện vào năm 2012, vừa công bố tại Hà Nội. Hơn 11.000 người tuổi 30-69 tại 6 vùng gồm: Miền núi phía Bắc, Đồng bằng sông Hồng, Duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Tây Nam Bộ đã tham gia nghiên cứu. Cụ thể, gần 6% dân số Việt Nam bị tiểu đường, trong đó tỷ lệ mắc cao nhất ở Tây Nam Bộ (hơn 7%), thấp nhất là Tây Nguyên (gần 4%). Tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose cũng gia tăng mạnh mẽ từ 7,7% năm 2002 lên gần 13% năm 2012. Tỷ lệ đối tượng điều tra có các yếu tố nguy cơ của bệnh ĐTĐ là 38.5%. Cũng qua số liệu điều tra, số bệnh nhân ĐTĐ không được chẩn đoán là 44%. Phần lớn người bệnh phát hiện và điều trị muộn. Vì vậy, mỗi năm có trên 70% bệnh nhân không được phát hiện và điều trị kịp thời.
Ở nước ta, đối tượng mắc bệnh ĐTĐ thường ở độ tuổi từ 30-65, tuy nhiên hiện nay có những bệnh nhân ĐTĐ mới chỉ 9-10 tuổi, điều này phản ánh sự trẻ hóa về bệnh này. Bên cạnh đó, biến chứng tim mạch do bệnh ĐTĐ luôn là biến chứng phổ biến và là nguyên nhân gây đột quỵ và tử vong hàng đầu ở người bệnh ĐTĐ. Vì thế, ĐTĐ không chỉ là mối quan tâm của ngành y tế mà còn thu hút cả sự chú ý của các nhà quản lý xã hội.
22
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1 Mẫu thực vật
+ Đối tượng nghiên cứu là lá cây Atisô (Cynara scolymus L.) thuộc chi
Cynara, Họ Cúc Asteraceae. + Bộ phận dùng: lá khô.
+ Địa điểm thu thập mẫu : Xuân Bảng - Nam Sơn – Sóc Sơn - Hà Nội.
Hình 2.1. Lá cây Atisô 2.1.2. Mẫu động vật
+ Chuột nhắt trắng là chủng Swiss 4 tuần tuổi (14-16g), do Viện Vệ sinh Dịch tễ TW cung cấp. Thức ăn tiêu chuẩn được mua tại Viện Vệ sinh Dịch tễ TW.
Thức ăn giàu lipid được trộn từ nhiều thành phần khác nhau như: Ngô, sữa bột nguyên kem, lạc, đậu tương, lòng đỏ trứng, mỡ lợn, dầu ăn phối trộn theo tài liệu và dựa theo bảng trích dẫn, phân tích của Viện Dinh Dưỡng Quốc gia [10].
23
Hình ảnh chuột nuôi béo phì Chuột nuôi béo phì và chuột nuôi thường
Hình 2.2. Mẫu động vật dùng trong thí nghiệm
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Tạo mô hình chuột béo phì và đái tháo đường
Chuột nhắt trắng chủng Swiss (14-16g) được nuôi giống nhau về không gian và thời gian nhưng với hai chế độ ăn khác nhau, lô thí nghiệm cho ăn thức ăn giàu lipit còn lô đối chứng cho ăn thức ăn thường của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương.
Sau thời gian từ 6-8 tuần, tiến hành cân trọng lượng của các lô chuột nuôi thí nghiệm, từ đó so sánh mức độ tăng trọng của các lô chuột được nuôi theo hai chế độ ăn khác nhau kể trên.
Chuột nuôi béo phì được gây đái tháo đường type II bằng tiêm STZ dưới màng bụng. Sau 3-4 ngày những con chuột này bị bệnh với nồng độ đường huyết 18mmol/lit.
2.2.2. Tách chiết các phân đoạn dịch chiết từ lá cây Atisô.
2.2.3. Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên trong lá cây Atisô, bằng phương pháp hoá học nhờ các thuốc thử đặc hiệu phương pháp hoá học nhờ các thuốc thử đặc hiệu
Để khảo sát sơ bộ thành phần hóa học trong lá cây Atisô chúng tôi tiến hành thực hiện định tính với thuốc thử. Mẫu thử được pha trong EtOH và chia vào các ống nghiệm.
24
2.2.3.1. Định tính flavonoid
+ Phản ứng Shinoda: Chuẩn bị ống nghiệm có chứa mẫu phản ứng, thêm một ít bột Mg, nhỏ thêm vài giọt acid HCl đặc sau đó đun sôi trên nồi cách thủy trong vài phút. Phản ứng này cho kết quả dương tính khi dung dịch xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam.
+ Phản ứng với sunfuric acid: các flavonoid phản ứng với sunfuric acid đặc sẽ cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
+ Phản ứng định tính catechin: nhỏ dung dịch mẫu lên giấy lọc, thêm dung dịch vanilin trong HCl đặc. Nếu kết quả cho màu đỏ son là phản ứng dương tính.
2.2.3.2. Định tính tannin
+ Phản ứng với vanilin: thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4. Phản ứng dương khi dung dịch có màu đỏ đậm.
+ Phản ứng với gelatin/NaCl: thêm vài giọt thuốc thử gelatin/NaClvào ống thí nghiệm. Phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục.
+ Phản ứng acetate chì: thêm vài giọt dung dịch acetate chì 10%. Phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện kết tủa.
2.2.3.3. Định tính alkaloid
Mẫu thử được pha trong các dung dịch acetic acid 2%
+ Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch acid HCl): Alkaloid cho kết tủa màu nâu sẫm khi phản ứng với thuốc thử Bouchardat.
+ Phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer (hỗn hợp HgCl2 và KI trong H2O): Alkaloid phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer cho kết tủa màu trắng ánh vàng.
25
2.2.3.4. Định tính glycoside
+ Phản ứng Keller-Killian: Chuẩn bị các dung dịch thuốc thử gồm dung dịch A: 0,5 ml dung dịch FeCl3 5% trong 50 ml acetic acid 10%. Dung dịch B: 0,5 ml dung dịch FeCl3 5% trong 50 ml sunfuric acid đặc. Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 1ml dung dịch A vào lắc nhẹ cho tan hết rồi nghiêng ống nghiệm cho từ từ dung dịch B vào. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng.
2.2.3.5. Định tính các polyphenol khác
+ Phản ứng với dung dịch kiềm: Các polyphenol phản ứng với dung dịch kiềm cho kết quả màu vàng.
+ Phản ứng với FeCl3: Thêm dung dịch FeCl3 trong HCl 0.5N vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu. Phản ứng dương tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen.
2.2.4. Định lƣợng polyphenol tổng số theo phƣơng pháp Folin-Ciocalteau
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. Đo độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng ở bước sóng 765 nm. Hàm lượng polyphenol tổng số được tính theo mg acid gallic chuẩn.
Hóa chất: Dung dịch gallic acid: (0,5 g acid gallic + 10 ml EtOH 96% + 90 ml H2O cất 2 lần); dung dịch Na2CO3 20%; thuốc thử Folin-Ciocalteau.
Phương pháp: Xây dựng đường chuẩn acid gallic bằng cách chuẩn bị các dung dịch acid gallic ở các nồng độ 50, 100, 150, 250, 500 mg/l.
Chuẩn bị cóng định lượng, cho vào mỗi cóng 20µl mẫu hoặc dung dịch chuẩn + 1.58 ml nước + 100µl thuốc thử Folin-Ciocalteau + 300 µl dung dịch Na2CO3.
Cách đo với dịch nghiên cứu: tiến hành như trên nhưng thay 0.02 ml (20µl) dịch chuẩn bằng dịch nghiên cứu được pha loãng thích hợp sao cho số đo nằm trong đường chuẩn.
26
2.2.5. Sắc ký lớp mỏng
Sắc kí lớp mỏng (TLC- thin layer choromatography) là kĩ thuật sắc ký khá nhanh gọn và tiện lợi. Nó giúp nhận biết nhanh được số lượng thành phần có trong mẫu nghiên cứu. Trong phương pháp sắc ký lớp mỏng, thành phần trong hỗn hợp được xác định nhờ so sánh hệ số lưu của hỗn hợp (Rf) và hệ số lưu của một số chất đã biết.
Nguyên tắc: Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp dùng để khảo sát sơ bộ thành phần các chất có trong mẫu nghiên cứu một cách nhanh chóng, dễ dàng. Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào mức độ tương tác của các chất khác nhau trong mẫu nghiên cứu với pha động (hệ dung môi chạy sắc ký) và pha tĩnh (bản mỏng). Pha tĩnh thường sử dụng là silicagel, Al2O3, cellulose, polyamide...
Phương pháp: Sử dụng bản Silicagel 60 F254 tráng sẵn với kích thước bản sắc ký là 20x20 cm. Các mẫu thí nghiệm được pha trong các dung môi thích hợp sau đó chấm mẫu vào các bản sắc ký cách đáy 1,5 cm và tiến hành chạy trong pha động là hệ dung môi Toluen: ethylacetate: acetone: acid formic (5:3:1:1). Sau khi chạy xong tiến hành nhuộm bản sắc ký bằng các thuốc thử và xác định hệ số Rf theo công thức: Rf = a/b. Trong đó a là khoảng di chuyển của chất nghiên cứu, b là khoảng di chuyển của dung môi.
2.2.6. Sử dụng phƣơng pháp hóa sinh – y dƣợc
Sử dụng phương pháp hóa sinh- y dược để định lượng một số chỉ số hóa sinh liên quan tới bệnh rối loạn chuyển hóa cacbohydrat khi hormone insulin của tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể trước và sau khi điều trị bằng các phân đoạn dịch chiết từ lá cây Atisô.
27
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả tách chiết và một số đặc tính hóa sinh của phân đoạn dịch chiết lá Atisô (Cynara scolymus L.) chiết lá Atisô (Cynara scolymus L.)
3.1.1. Quy trình tách chiết
Ngâm 3000g lá cây Atisô (Cynara scolymus L.) đã sấy khô trong 10lít ethanol 96% trong thời gian 7 ngày rồi đổ lượng dịch thu được ra bình và bảo quản, làm tương tự như vậy 3 lần. Dịch chiết thu được đem cô đặc dưới bóng đèn sợi đốt (tránh nhiệt độ cao làm biến tính các hợp chất có trong mẫu và tránh cho sự bay hơi của ethanol quá nhanh) tạo thành 160g dạng cao và bảo quản trong tủ lạnh.
Tiếp tục ngâm mẫu (sau khi đã ngâm với ethanol) với n-hexan trong vòng 10 ngày sau đó thu dịch chiết và cô dưới đèn sợi đốt như trên tạo thành 62.5g dạng cao và bảo quản trong tủ lạnh.
Tiếp tục ngâm mẫu (sau khi đã ngâm với n-hexan) với ethylacetate trong vòng 10 ngày sau đó thu dịch chiết và cô dưới đèn sợi đốt như trên tạo thành 51.5g dạng cao và bảo quản trong tủ lạnh.
Hình 3.1. Mô hình chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ lá Atisô.
Bã sau khi chiết bằng n-hexan 62.5g Cao PĐ n –hexan
Chiết bằng n-hexan
160g Cao PĐ ethanol Bã sau khi chiết bằng ethanol Chiết ethanol 3 lần 3000g lá cây Atisô
Bã sau khi chiết bằng ethylacetate 51,5g Cao PĐethylacetate
28
Khối lượng mẫu thu được khi lần lượt chiết qua các dung môi của lá cây Atisô được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết rút các phân đoạn từ lá cây Atisô
Phân đoạn Số gam thu được (g)
Hiệu suất chiết rút (% nguyên liệu khô)*
Cao ethanol 160 5,33
Cao n – hexan 62,5 2,08
Cao ethylacetate 51,5 1,72
(* Tính theo nguyên liệu khô ban đầu)
Như vậy từ phương pháp chiết rút được trình bày ở hình 3.1 chúng tôi đã thu được một số cao phân đoạn tan trong các dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Kết quả định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết lá Atisô đoạn dịch chiết lá Atisô
Để xác định thành phần hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết các phân đoạn của lá Atisô đã cô thành cao gồm có: cao cồn tổng số (cao EtOH), n- hexan, EtOAc (ethyacetate). Chúng tôi tiến hành định tính thành phần một số hợp chất tự nhiên thông qua các phản ứng hóa học và một số thuốc thử tương ứng.
29
Bảng 3.2. Kết quả định tính các phân đoạn dịch chiết lá Atisô.
Nhóm chất Thuốc thử Mẫu Cao ethanol Cao n- hexan Cao ethylacetat Flavonoid Shinoda + - + Diazo ++ ++ +++ H2SO4 đặc + + + Tannin Vanilin + - - Gelatin/NaCl ++ + + Acetat chì + + - Polyphenol khác NaOH 10% + + ++ FeCl3 5% ++ + + Glycoside Keller-killian + + ++ Alkaloid Mayer ++ ++ + Dragendroff + ++ ++ Bouchardat + ++ + Saponin Tạo bọt ++ ++ +
(Ghi chú: (+): Các mức phản ứng dương tính (-): Phản ứng âm tính; Mức độ phản ứng được thể hiện bằng số dấu cộng)
Kết quả định tính cho thấy thành phần các hợp chất trong lá cây Atisô khá phong phú, có đầy đủ các nhóm hợp chất tự nhiên phổ biến như: flavonoid, tannin, alkaloid và glycoside. Trong đó, ở phân đoạn cao ethanol, n- hexan, ethylacetat hầu hết các phản ứng với các nhóm chất đều là dương tính; phân đoạn cao ethanol có chứa tương đối đầy đủ các chất. Các chất thấy
30
với hàm lượng nhiều là flavonoid, polyphenol, glycoside; các chất còn lại có nhưng với hàm lượng ít. Trong phân đoạn EtOAc chứa rất nhiều các chất như polyphenol, glycoside. Từ bảng 3.2 ta thấy ở phân đoạn cao EtOH và phân đoạn cao ethylacetat chứa rất nhiều polyphenol và mức phản ứng mạnh, chứng tỏ là hợp chất có hoạt tính sinh học cao, có khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư. Kết quả định tính này giúp chúng tôi có những định hướng để tiếp tục nghiên cứu ở mức độ cao hơn.
3.1.3. Phân tích thành phần hóa học trong các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng mỏng
Chúng tôi đã tiến hành chạy sắc kí bản mỏng tráng sẵn sillicagel Merck Alufolien 60 F254 với nhiều hệ dung môi khác nhau. Qua thăm dò chúng tôi thấy hệ dung môi TEAF (5:3:1:1) hay (Toluen- Ethylacetate– Acetone- acid Fomic) là cho kết quả rõ nét nhất và được chúng tôi lựa chọn.
Hình 3.2. Sắc kí đồ các phân đoạn dịch chiết lá cây Atisô
Ghi chú : 1- cao EtOH 2- cao n- hexan
3- cao EtOAc
31
Qua quan sát sắc ký đồ chúng ta thấy có nhiều băng vạch với nhiều màu sắc khác nhau như: màu vàng, màu tím, màu xanh (đặc trưng của flavonoid) chứng tỏ trong lá cây Atisô chứa khá đầy đủ các loại hợp chất polyphenol. Điều này đã hoàn toàn phù hợp với kết quả định tính ở trên và là cơ sở cho chúng tôi quyết định chọn các phân đoạn EtOH, n-hexan và EtOAc vào mô hình chuột thí nghiệm trong những nghiên cứu tiếp theo.
3.1.4. Hàm lượng polyphenol tổng số trong cao dịch chiết các phân đoạn 3.1.4.1. Xây dựng đường chuẩn acid gallic 3.1.4.1. Xây dựng đường chuẩn acid gallic
Đường chuẩn acid gallic được xây dựng bằng cách chuẩn bị các dung dịch acid gallic ở các nồng độ 50, 100, 150, 250, 500 mg/l, tiến hành so màu trên máy ERMA ở bước sóng λ = 765nm. Kết quả được thể hiện ở hình 3.3 và bảng 3.3
Bảng 3.3. Kết quả đƣờng chuẩn gallic
STT Acid gallic (mg/l) OD 765nm 1 0 0.009 2 50 0.062 3 100 0.119 4 150 0.168 5 250 0.265 6 500 0.519
32
Hình 3.3. Kết quả đường chuẩn gallic
3.1.4.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin- Ciocalteau Ciocalteau
Định lượng polyphenol của dịch chiết các phân đoạn bằng phương pháp Folin- Ciocalteau. Dịch chiết mẫu cho phản ứng với thuốc thử Folin- Ciocalteau tạo ra sản phẩm có màu xanh. So màu trên máy ERMA ở bước sóng µ = 765nm, dùng chất chuẩn là acid gallic để định lượng polyphenol. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4. Kết quả hàm lƣợng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết Mẫu Phân đoạn OD765nm Hàm lượng (mg) Cao cồn (EtOH) 0.17 157.2 n-hexan 0.28 267.2 Ethylacetate (EtOAc) 1.43 1417.2
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy hàm lượng polyphenol trong phân đoạn cao EtOAc chiếm tỉ lệ cao nhất, tiếp đó là n-hexan và thấp nhất là ethanol.
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 400 500 600 OD 765nm OD… y = 0.001x + 0.0128 R2 = 0.9997
33
3.2. Kết quả xác định liều độc cấp
Xác định LD50 của dịch chiết ethanol tổng số từ lá cây Atisô trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp của Lorke. Chuột cho nhịn đói trước 16 giờ thí nghiệm, được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 5 con và được cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg thể trọng. Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết lá cây Atisô qua bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả thử độc tính cấp theo đƣờng uống.
Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết
6500mg/kg 10 0 0%
7000mg/kg 10 0 0%
7500mg/kg 10 0 0%
8000mg/kg 10 0 0%
Sau 72 giờ theo dõi với các liều 6500, 7000, 7500 mg/kg thể trọng thấy không có con chuột nào chết. Đến liều cao nhất 8000mg/kg thể trọng cũng không có con nào chết, vì vậy chưa tính được LD50, nghĩa là có thể kết luận các phân đoạn dịch chiết từ lá cây Atisô hoàn toàn không độc dù ở liều rất cao