ADN là cơ sở hóa học của gien. Phân tử ADN là một chuỗi xoắn kép của hai mạch đơn được cấu tạo từ 4 loại nucleotide khác nhau nhờ các base của chúng, đó là: A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine). Các nucleotide này nối kết liên tiếp với nhau theo một thứ tự xác định. Giải trình tự của gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotide này trên phân tử ADN.
Các phƣơng pháp giải trình tự gien
1.6.5.1. Phương pháp hóa học giải trình tự ADN
Vào năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh được một phương pháp hóa học để có thể giải trình tự một đoạn ADN. Nguyên tắc của phương pháp này là:
1. Trước hết là phải đánh dấu một đầu của đoạn ADN cần phải giải trình tự bằng một gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P);
2. Xử lý các đoạn ADN đã đánh dấu này với chất hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn ADN. Ví dụ, sử dụng dimethylsulphate để biến đổi Guanine bằng cách thêm một gốc methyl ở vị trí nitrogen thứ 7 (N7); hydrazine làm biến đổi Thymine và Cytosine; hydrazine và NaCl làm biến đổi Cytosine; acid để làm biến đổi Guanine và Adenine; NaOH để làm biến đổi Adenine và Cytosine với Adenine ưu tiên hơn Cytosine. Như vậy trong giai đoạn này, phải dùng ít nhất 4 ống nghiệm và trong mỗi ống nghiệm, ADN được xử lý với một lượng rất giới hạn của một trong các chất hóa học nêu trên để mỗi ống nghiệm chỉ có chứa các đoạn ADN mà trên mỗi đoạn ADN này chỉ có một vị trí nucleotide đặc hiệu với chất hóa học là bị biến đổi;
3. Các nucleotide bị biến đổi này sẽ bị lấy ra khỏi mạch khung đường- phosphate (sugar-phosphate backbone) của đoạn ADN và nhờ đó tách ra được các đoạn mạch đơn có một đầu đánh dấu 32
P và một đầu bị mất phân tử base vì phân tử này đã bị lấy ra khỏi mạch khung;
4. Thực hiện điện di mẫu ADN đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4 hàng của một gel polyacrylamide biến tính để các mạch đơn trong mẫu di
chuyển trong gel không bị biến đổi trong quá trình điện di. Nhờ đó, sau khi hoàn tất điện di, các mạch đơn sẽ bị dừng tại các vị trí khác nhau, tùy thuộc vào mạch đơn này dài ngắn khác nhau, theo hàng dọc suốt chiều dài của gel. Áp gel đã điện di này trên một phim nhạy tia X, các vị trí dừng lại của các mạch đơn trên gel điện di sẽ tạo thành các vạch trên phim vì các vị trí này đều bị đánh dấu phóng xạ do các mạch đơn đều có một đầu được đánh dấu bằng 32P. Từ các vạch trên phim xạ ký tự ghi này (autoradiography), có thể đọc được trình tự của các nucleotide của đoạn ADN [14].
Phương pháp hóa học xác định trình tự ADN của Maxam và Gilbert trên thực tế
không phải dễ thực hiện vì cần phải xác định khá nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm,
trong đó khó nhất là phải xác định được nồng độ giới hạn nhất của các chất hóa học sao cho khi xử lý mẫu ADN thì trên mỗi đoạn ADN chỉ có một base bị biến đổi để ứng với mỗi vị trí của base bị biến đổi thì sẽ có một mạch đơn có đầu đánh dấu 32
P được tách ra. Chính vì sự phức tạp này, phương pháp Maxam Gilbert hiện nay ít được sử dụng, mà thay vào đó các nhà khoa học dùng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội hơn
1.6.5.2. Phương pháp enzyme giải trình tự ADN
Phương pháp enzyme được Sanger và các cộng sự phát minh cũng vào năm 1977, và ngày hôm nay phương pháp này càng ngày càng được hoàn thiện và thực hiện dễ dàng tại các phòng thí nghiệm. Nguyên tắc chung của phương pháp này có thể tóm tắt như sau:
Trước hết chèn các đoạn ADN cần phải xác định trình tự vào một vector là phage hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này đã được xác định rõ. Chuyển thể tức là đưa các vector mang đoạn chèn ADN này vào tế bào vi khuẩn để nhân bản các vector này thành nhiều bản sao, sau đó tách chiết và tinh khiết các vector từ vi khuẩn để thành các vector tự do.
trí chèn đoạn ADN. Thêm vào ống phản ứng men ADN polymerase và 4 loại nucleotide tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và một lượng rất giới hạn các nucleotide tận (terminator, là ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, cũng như dNTP, có 4 loại ddNTP tương ứng với 4 base A, T, C và G). Phản ứng được thực hiện trong 4 ống, và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau. Bắt đầu từ đoạn mồi, men ADN polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch ADN chèn trên vector, và sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng lại tại vị trí mà ddNTP được kéo vào thay vì dNTP. Lý do sự tổng hợp bị dừng lại là vì ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose, mà gốc OH tại vị trí này chính là nơi để dNTP kế tiếp được gắn vào. Nhờ vậy trong ống phản ứng có các mạch đơn ADN có các chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn ADN gốc.
Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính. Với phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP bằng đồng vị phóng xạ 32P hay 35S thì sau khi điện di, cũng giống như phương pháp của Maxam và Gilbert, người ta phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi, và từ các vạch này giải được trình tự của đoạn ADN [14].
1.6.5.3. Giải trình tự bằng máy tự động
Các phòng thí nghiệm hiện nay hầu hết giải trình tự gien bằng phương pháp enzyme, sử dụng máy tự động chứ không dùng kỹ thuật xạ ký tự ghi như trước đây. Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch ADN đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Cấu tạo của một máy tự động giải trình tự gồm hai phần chính yếu, đó là: phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di. Phần điện di polyacrylamide có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di,
mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn ADN.
Với các máy thế hệ mới sau này, người ta có thể dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được chỉ trong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng mà không cần phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây. Nếu dùng diện di mao quản thì tùy thuộc vào số mao quản có thể chạy một lần mà người làm thí nghiệm có thể có số mẫu cho mỗi lần chạy nhiều hay ít. Tùy thuộc vào qui mô của phòng thí nghiệm cùng với số mẫu giải trình tự mà phòng thí nghiệm có thể trang bị giải trình tự ít hay nhiều mao quản. Ví dụ với ABI thì có nhiều loại: chỉ 1 mao quản, 4 mao quản, 16 mao quản, 48 mao quản, rồi 96 mao quản. Nhưng nay do nhu cầu nghiên cứu và dịch vụ ngày càng nhiều nên đã trang bị thêm ABI 3130XL có đến 16 mao quản . Các thế hệ máy về sau ngày càng có những chương trình đi kèm để chẳng những có thể hiển thị tự động các ký tự hoá học của trình tự ADN mà còn giúp các nhà nghiên cứu có thể: (1) Phát hiện các chi tiết cần thiết trên trình tự như mã khởi đầu, mã kết thúc, vùng đọc mở (ORF: Open Reading Frame), trình tự đặc hiệu cho các enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme), các dấu ấn di truyền...mà các chi tiết này rất cần thiết để lập bản đồ gen...(2) Phiên dịch trình tự trong vùng đọc mở (tức là vùng trình tự có ý nghĩa) thành trình tự acid amin của một protein, nhờ đó có thể xác định, phỏng đoán, hay làm cơ sở ban đầu để hiểu được chức năng của gen...(3) Tự động so sánh trình tự ADN trong thí nghiệm hay một trình tự ADN nạp vào máy, hay có thể trình tự acid amin của protein, với các trình tự khác đã có trong ngân hàng dữ liệu để phát hiện được sự tương đồng với trình tự đã biết, nhờ đó làm cơ sở để xác định gien và chức năng gien [14].
máy tự động bằng máy ABI 3100 Avant Genetic Analyser (Applied Biosystems; Mỹ).
CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
- 102 mẫu bệnh phẩm dịch não tuỷ, nước bọt được lấy từ 63 bệnh nhân nghi dại điều trị tại viện Các Bệnh Truyền Nhiễm và Nhiệt Đới Quốc Gia; khoa truyền nhiễm, bệnh viện Bạch Mai. Các bệnh nhân này tới từ các tỉnh miền Bắc Việt Nam, sau khi được chẩn đoán lâm sàng tại các trung tâm y tế của tỉnh được chuyển lên tuyến trên để điều trị và lấy mẫu.
- 150 con chó ở lò mổ của huyện Hoài Đức, Hà Nội (Hà Tây cũ) và các tỉnh lân cận. Chó có một trong các triệu chứng như bỏ ăn, kích thích, chảy nước dãi được mổ sọ lấy não vùng đồi thị và tiểu não.
- 6 mẫu não từ chó nghi dại có các triệu chứng như thay đổi hành vi, cắn nhiều người, cắn động vật khác, tìm chỗ tối chỗ vắng nằm trong bóng tối thu thập được từ một số tỉnh miền núi phía Bắc là Lào Cai, Sơn La và Yên Bái. - 4 chủng vi rút dại hoang dại phân lập được từ chó mắc dại tại Việt Nam từ năm 2006 – 2012.
- Tất cả các mẫu bệnh phẩm phải được đóng gói theo tiêu chuẩn đóng gói mẫu bệnh phẩm loại A, đảm bảo 3 lớp và bảo quản trong lạnh khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Chủng vi rút
Chủng chuẩn vi rút dại CVS: Phòng thí nghiệm Vắc xin và sinh phẩm thực nghiệm, Viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp. Chủng vi rút này được nhân trên tế bào (để làm chứng dương cho kỹ thuật tách chiết ARN từ dịch) và cấy truyền trên chuột (để làm chứng dương cho kỹ thuật tách chiết ARN từ mô) trong chẩn đoán dại bằng kỹ thuật RT – PCR.
2.2.2. Trình tự gien
Trình tự nucleotide của gien N của các chủng vi rút được tham khảo tại ngân hàng gien thế giới (GenBank) tại địa chỉ website: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ với các mã gien đăng ký và tên chủng như sau:
- 7 chủng đại diện cho 7 genotype thuộc Lysavirus: X03673 - PV; D42112 - CVS; U22848 - Duvenhage virus; EU822500 - European bat
Lyssavirus 1 ; EU293114 - European bat Lyssavirus 2; AY573964 - Australian bat Lyssavirus; U22842 - Lagos bat virus; MVU22843 - Mokola virus;
- 8 chủng vi rút ở Miền Nam và Tây nguyên Việt Nam: AB614375; AB614376; AB628213; AB614373; AB614374; AB628211; AB614377; AB614378.
- Một số chủng vi rút dại lưu hành trên thế giới như Pháp, Nga, Ba Lan, Nam Phi, Mexico, Brazil…: U22477, ME9126; U22627, EGY8692; U22637, ETH8807; U22641, GUI9024; U22633, AFS8721; U22656, RUS9141; U22474, FRA9147; U22840, POL8618; U22479, BRAZIL. - Một số chủng vi rút dại lưu hành ở khu vực lân cận như Trung Quốc,
Malaysia, Philippines, Nepal: U22918, 94260NEP; U22653, 8738THA; U22916, 8677MAL; AB070817PHI; EF555106, SDJNCN01; EF555102, CQQJDN06; EF555112, GDZQDN45; EF555098, CQQJDN02; EF555099, CQQJDN03; EF555100, CQQJDN04; EF555101, CQQJDN05; AB299032, AB299033, AB299034, AB299035, AB299036, AB299037, AB299038, AB299039 VN.
2.2.3. Sinh phẩm, hóa chất
Bộ sinh phẩm tách chiết ARN (QIQamp Viral RNA Mini kit – QIAGEN, Đức);
Bộ sinh phẩm tách chiết ARN từ mẫu mô (Rneasy Lipid Tissue - QIAGEN, Đức);
Bộ sinh phẩm tinh sạch ADN (QIAquick Gel Extraction Kit – QIAGEN, Đức);
Bộ sinh phẩm tinh sạch ADN (QIAquick PCR Purification Kit – QIAGEN, Đức);
Sinh phẩm dùng cho phản ứng PCR giải trình tự gien (BigDye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kit, ABI, Mỹ) .
Bộ kít tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự (DyeEx 2.0 Spin Kit – QIAGEN, Đức);
Dung dịch TRIzol của GIBCO, Mỹ.
Cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen N của Lyssavirus N7 (vị trí 55 – 82) và JW6E (vị trí 641 – 660) có trình tự nucleotide như sau:
JW6E: 5’ CAG TTG GCA CAC ATC TTG TG 3’ N7 : 5’ ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG 3’
Thang chuẩn ADN GelPilot Mid Range Ladder (100) của QIAGEN, Đức;
Loading dye 5X của QIAGEN, Đức;
Thạch agarose LE (Roche, Pháp);
Dung dịch TAE 50X (Bio-rad, Mỹ);
Ethidium bromide (Bio-rad, Mỹ);
Nước nổi nuôi cấy tế bào NA (C1300)
Các sinh phẩm, hóa chất và vật liệu cần thiết khác để thực hiện kỹ thuật RT – PCR và sequencing.
2.2.4. Trang thiết bị, dụng cụ
a) Trang thiết bị
Phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ III; (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Máy PCR;
Máy điện di;
Máy ly tâm lạnh;
Máy lắc Vortex;
Cân điện tử;
Máy định lượng ADN (Nano Drop, Mỹ)
Lò vi sóng;
Máy giải trình tự gien ABI 3100-AvantTM Genetic Analyser (Applied Biosystems; Mỹ) với gel POP-6
Các trang thiết bị và vật liệu cần thiết khác để thực hiện kỹ thuật PCR và sequencing.
b) Dụng cụ
Tuýp eppendorf: 2 ml, 1,5 ml, 0,5 ml, 0,2 ml;
Đầu côn các loại: 10 l, 20 l, 100 l, 200 l, 1000 l;
Pippet tự động các loại: 1-10 l, 2-20 l, 20-100 l, 20-200 l, 200 -1000 l;
Chày cối sứ;
Nhiệt kế;
Khuôn thạch.
2.2.5. Phần mềm phân tích trình tự nucleotide
Làm sạch số liệu bằng phần mềm BioEdit và Chromas. So sánh cặp và sắp xếp đa trình tự nucleotide và xây dựng cây di truyền bằng phần mềm MEGA, phiên bản 4.0 (theo phương pháp neighbor – joining) với giá trị để tính phần trăm sự lặp lại (giá trị tin cậy) tại mỗi nhánh phát sinh là 1000 lần. Xác định độ tương đồng của axit amin bằng phần mềm Lasergene. Sử dụng trình tự nucleotide của chủng Mokola làm chủng đối chiếu khác genotype và các chủng hoang dại lưu hành ở Việt Nam trong những năm trước và các vùng địa lý lân cận Trung Quốc, Thái Lan, Phillipines… tại ngân hàng gien - GenBank để so sánh mối liên quan gien N của các chủng vi rút dại phân lập tại Việt Nam từ 2006 – 2012 và xây dựng cây di truyền.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp thử nghiệm phòng thí nghiệm. Các mẫu được tiến hành phân tích theo hình 2.1.
Chủng Vi rút Dại hoặc
Mẫu bệnh phẩm nghi chứa vi rút dại
Tách chiết ARN của vi rút
Thực hiện phản ứng one-step
RT-PCR để khuếch đại đoạn gien đặc hiệu
Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR
Tinh sạch sản phẩm RT-PCR (trực tiếp hoặc cắt gel)
Thực hiện phản ứng PCR giải trình tự Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ ADN
Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự
Giải trình tự nucleotide gien N bằng máy AB 3100 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Làm sạch số liệu, dựng cây di truyền và phân tích đặc điểm genotype
2.3.1. Xác định và định týp vi rút
2.3.1.1. Xác định vi rút bằng kỹ thuật RT-PCR
a/Tách chiết và tinh sạch ARN
Được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ III
Quy trình tách chiết ARN từ nước bọt, dịch não tuỷ
Sử dụng bộ kít tách chiết ARN từ dịch cơ thể - QIAamp Viral RNA Mini kit,
các bước được thực hiện theo hướng dẫn của hãng sản xuất. Quy trình tóm tắt như sau:
1) Cho 140 µl mẫu bệnh phẩm (nước bọt, dịch não tuỷ), chủng vi rút
phân lập trên tế bào, chứng dương (nước nổi nuôi cấy chủng CVS