Làm sạch số liệu bằng phần mềm BioEdit và Chromas. So sánh cặp và sắp xếp đa trình tự nucleotide và xây dựng cây di truyền bằng phần mềm MEGA, phiên bản 4.0 (theo phương pháp neighbor – joining) với giá trị để tính phần trăm sự lặp lại (giá trị tin cậy) tại mỗi nhánh phát sinh là 1000 lần. Xác định độ tương đồng của axit amin bằng phần mềm Lasergene. Sử dụng trình tự nucleotide của chủng Mokola làm chủng đối chiếu khác genotype và các chủng hoang dại lưu hành ở Việt Nam trong những năm trước và các vùng địa lý lân cận Trung Quốc, Thái Lan, Phillipines… tại ngân hàng gien - GenBank để so sánh mối liên quan gien N của các chủng vi rút dại phân lập tại Việt Nam từ 2006 – 2012 và xây dựng cây di truyền.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp thử nghiệm phòng thí nghiệm. Các mẫu được tiến hành phân tích theo hình 2.1.
Chủng Vi rút Dại hoặc
Mẫu bệnh phẩm nghi chứa vi rút dại
Tách chiết ARN của vi rút
Thực hiện phản ứng one-step
RT-PCR để khuếch đại đoạn gien đặc hiệu
Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR
Tinh sạch sản phẩm RT-PCR (trực tiếp hoặc cắt gel)
Thực hiện phản ứng PCR giải trình tự Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ ADN
Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự
Giải trình tự nucleotide gien N bằng máy AB 3100
Làm sạch số liệu, dựng cây di truyền và phân tích đặc điểm genotype
2.3.1. Xác định và định týp vi rút
2.3.1.1. Xác định vi rút bằng kỹ thuật RT-PCR
a/Tách chiết và tinh sạch ARN
Được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ III
Quy trình tách chiết ARN từ nước bọt, dịch não tuỷ
Sử dụng bộ kít tách chiết ARN từ dịch cơ thể - QIAamp Viral RNA Mini kit,
các bước được thực hiện theo hướng dẫn của hãng sản xuất. Quy trình tóm tắt như sau:
1) Cho 140 µl mẫu bệnh phẩm (nước bọt, dịch não tuỷ), chủng vi rút
phân lập trên tế bào, chứng dương (nước nổi nuôi cấy chủng CVS trên tế bào) và chứng âm (nước nổi nuôi cấy tế bào NA) vào tuýp chứa 560 µl dung dịch ly giải vi rút AVL, trộn đều bằng máy vortex và ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút.
2) Thêm 560 µl ethanol (96 – 100%) vào mỗi tuýp, trộn đều..
3) Cho 630 µl (một nửa) dung dịch trên vào cột và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ phần dịch lọc qua màng.
4) Cho nốt phần còn lại (630 µl) của mẫu vào cùng một cột trên, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ phần dịch lọc qua màng.
5) Cho 500 µl dung dịch rửa AW1 có chứa ethanol 100%, sau đó ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch lọc qua màng.
6) Cho 500 µl dung dịch rửa AW2 có chứa ethanol 100%, sau đó ly tâm 14.000 vòng/phút trong 3 phút, loại bỏ dịch lọc qua màng.
7) Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút các cột trên để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa.
8) Thu hồi ARN bằng cách cho thêm 60 µl dung dịch đệm AVE, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Khi ly tâm toàn bộ ARN của mẫu sẽ được thu hồi trong dịch lọc.
Quy trình tách chiết ARN từ mô.
Sử dụng bộ kít tách chiết Rneasy Lipid Tissue của QIAGEN, tiến hành theo hướng dẫn của hãng sản xuất. Quy trình tóm tắt như sau:
1) Dùng pince lấy mảnh não có kích thước khoảng 3mm3, chứng dương (não chuột gây nhiễm chủng CVS) và chứng âm (não chuột lành) cho vào cối đã ghi mã hoá mẫu. Nghiền đồng nhất mô não.
2) Cho 1ml dung dịch ly giải QiAgen lysis vào nghiền đồng nhất để ly giải tế bào, nhẹ nhàng tránh tạo bọt, trộn đều, ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
3) Thêm 200µl chloroform , trộn đều, ủ trong 2 – 3 phút ở nhiệt độ phòng.
4) Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C.
5) Hút pha trong cho vào tuýp eppendoft mới, cho tiếp lượng tương đương (khoảng 700 µl) ethanol 70%, lắc đều, để tủa ARN.
6) Cho 700 µl (một nửa) hỗn dịch trên vào cột, ly tâm 8.000 vòng/giây trong 15 giây; Loại bỏ dịch lọc qua màng.
7) Cho nốt phần còn lại (700 µl) của mẫu vào cùng một cột trên, ly tâm 8.000 vòng/giây trong 15 giây, loại bỏ phần dịch lọc qua màng
8) Cho 700 µl dung dịch rửa RW1 có chứa ethanol 100%, sau đó ly tâm 8.000 vòng/giây trong 15 giây, loại bỏ dịch lọc qua màng.
9) Cho 500 µl dung dịch rửa RPE có chứa ethanol 100%, sau đó ly tâm 8.000 vòng/giây trong 15 giây, loại bỏ dịch lọc qua màng.
10) Rửa cột thêm 500 µl dung dịch rửa RPE, ly tâm 8.000 vòng/giây trong 15 giây; loại bỏ dịch lọc qua màng.
11) Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút các cột trên để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa.
12) Thu hồi ARN bằng cách cho thêm 50 µl dung dịch đệm Rnase free water, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Khi ly tâm toàn bộ ARN của mẫu sẽ được thu hồi trong dịch lọc.
Bảo quản ARN ở - 800C.
b/ Phản ứng RT – PCR
Chuẩn bị hỗn dịch cho một phản ứng có thể tích 50µl (RT – PCR mixture)
Chất phản ứng 1 phản ứng
Nước cất 20 l
dNTPs 2 l
Dung dịch đệm phản ứng (5x Buffer) 10 l
Mồi ngược (JW6E – 10 pmol/µl) 3 l
Mồi xuôi (N7 – 10 pmol/µl) 3 l
Enzym mix 2 l ARN 10 l Tổng thể tích 50 l Chu kỳ nhiệt 500C: 30 phút 950C: 15 phút 94oC: 1 phút 540C: 1 phút 35 chu kỳ 720C: 1,5 phút 720C: 10 phút 40C: ∞
Độ dài đoạn ADN khuếch đại: Đoạn ADN đặc hiệu được khuếch đại bằng RT – PCR, sử dụng cặp mồi N7 và JW6E có độ dài là 600bp.
c/ Chạy điện di trên thạch agarose 2% để kiểm tra sản phẩm RT – PCR
- Viết sơ đồ điện di gồm thang ADN chuẩn; các mẫu bệnh phẩm; chứng dương, chứng âm.
- Trộn 5 µl sản phẩm PCR với 1 µl dung dịch loading dye sau đó nhỏ vào các giếng trong bản gel agarose 2% theo sơ đồ điện di (agarose được pha trong TAE 1X đã bổ sung ethidium bromide 4%)
- Chạy điện di trong thời gian 30 phút, 110V trong dung dịch đệm TAE 1X.
- Đọc kết quả bằng máy Gel.doc.
- Nhận định kết quả: dương tính khi mẫu thử xuất hiện băng ADN tương ứng ở vị trí 600bp tương tự như chứng dương. Chứng dương, chứng âm đạt tiêu chuẩn.
2.3.1.2. Xác định týp vi rút
Định týp vi rút được thực hiện bằng kỹ thuật giải trình tự gien N và dựng cây phả hệ, sử dụng trình tự gien N của các chủng đại diện cho 7 genotype của
lyssavirus.
a/ Kỹ thuật sequencing: Thực hiện kỹ thuật sequencing trực tiếp từ sản phẩm PCR
ADN từ sản phẩm PCR được tinh sạch trực tiếp hoặc qua gel bằng bộ sinh phẩm QIAquick Gel Extraction Kit, xác định độ tinh sạch và nồng độ ADN để đưa vào phản ứng PCR giải trình tự bằng điện di trên thạch 2% so sánh với hàm lượng ADN của thang chuẩn.
Tinh sạch ADN từ sản phẩm PCR:
Tinh sạch sản phẩm PCR qua gel agarose:
Sử dụng bộ sinh phẩm QIAquick Gel Extraction Kit của QIAGEN, quy trình kỹ thuật thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất sinh phẩm.
Dùng dao mỏng cắt đoạn thạch có chứa sản phẩm PCR, cho vào tuýp ly tâm 1,8ml không màu.
Xác định trọng lượng thạch có chứa sản phẩm PCR (trọng lượng của tuýp có chứa thạch trừ đi trọng lượng của tuýp khi chưa có thạch). Cho 3 thể tích buffer QG (chuẩn bị theo hướng dẫn) vào 1 thể tích thạch.
Ủ ở nhiệt độ 500
C trong thời gian 10 phút (cho đến khi thạch đồng nhất hoàn toàn); trong quá trình ủ thỉnh thoảng lắc nhẹ hoặc có thể trộn bằng máy Vortex sau 2-3 phút ủ.
Cho 1 thể tích dung dịch Isopropanol nguyên chất vào tuýp trên.
QIAquick spin và ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút; loại bỏ dịch qua màng.
Cho 0,5 ml dung dịch QG vào cột QIAquick spin và ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút; loại bỏ dịch qua màng.
Cho 0,75 ml dung dịch PE vào cột QIAquick spin và ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút; loại bỏ dịch qua màng.
Ly tâm thêm cột trên ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Đặt cột QIAquick spin vào tuýp 1,8ml vô trùng. Để thu toàn bộ lượng ADN tinh khiết, cho 50 µl dung dịch EB vào chính giữa cột QIAquick spin giữ thẳng đứng trong thời gian 1 phút, và ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Kiểm tra lại sản phẩm DNA tinh khiết trên thạch 2%.
Tinh sạch sản phẩm PCR trực tiếp:
Sử dụng bộ sinh phẩm QIAquick Gel Extraction Kit của QIAGEN, quy trình kỹ thuật thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất sinh phẩm
Cho 5 thể tích buffer PB vào 1 thể tích sản phẩm phản ứng PCR, trộn đều bằng máy Vortex.
Hút toàn bộ dung dịch có chứa ADN trong tuýp trên cho vào cột QIAquick column và ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút, để gắn ADN; loại bỏ dịch qua màng
Cho 0,75 ml dung dịch PE vào cột và cột QIAquick column và ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút; loại bỏ dịch qua màng.
Ly tâm thêm cột trên ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Đặt cột QIAquick column vào tuýp 1,8ml vô trùng. Để thu toàn bộ lượng ADN tinh khiết, cho 50 µl dung dịch EB vào chính giữa cột QIAquick column giữ thẳng đứng trong thời gian 1 phút, và ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Kiểm tra lại sản phẩm DNA tinh khiết trên thạch 2%. Phản ứng PCR để giải trình tự gien:
Phản ứng PCR giải trình tự được thực hiện trong 2 phản ứng với lần lượt 2 cặp mồi JW6E và N7 nhằm thu được đoạn trình tự có độ dài mong muốn.
Chuẩn bị hỗn hợp cho phản ứng tương ứng với mỗi đoạn mồi xuôi và mồi ngược. Big Dye Terminator pha loãng theo tỷ lệ 1:3 với dung dịch đệm Big Dye buffer. Các đoạn mồi xuôi và ngược được pha loãng từ nồng độ 10 pmol/ µl từ nồng độ 3,2 pmol/ µl.
Với mồi xuôi - N7: 5’ ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG 3’
Chất phản ứng 1 1 phản ứng
Big Dye Terminator (1:3) 8 µl
Nước cất 10 µl
Mồi xuôi – N7 (3,2 pmol/ µl) 1 µl
ADN khuôn (25-100pmol/ µl) 1 µl
Tổng số 20 µl
Với mồi ngược – JW6E: 5’ CAG TTG GCA CAC ATC TTG TG 3’
Chất phản ứng 2 1 phản ứng
Big Dye (1:3) 8 µl
Nước cất 10 µl
Mồi ngược – JW6E (3,2 pmol/ µl) 1 µl
ADN khuôn (25-100pmol/ µl) 1 µl
Tổng số 20 µl
- Chu trình nhiệt phản ứng PCR giải trình tự:
960C 1 phút 960C 10 giây 500C 5giây 25X 600C 4 phút 720C 10 phút 40C ∞
Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự gien:
Mục đích: loại bỏ các Bigdye terminators còn dư và các thành phần dư khác trong dung dịch đệm (buffers) trước khi tiến hành điện di mao quản nhằm thu được tín hiệu tốt hơn trên máy giải trình tự tự động.
Phƣơng pháp: Sản phẩm PCR giải trình tự gien được tinh sạch bằng bộ kít Dye Ex 2.0 Spin để loại bỏ các thành phần thừa như sau:
- Ly tâm cột Dye Ex ở 2800 vòng/ 2 phút - Chuyển cột sang eppendoft 1.5ml - Ghi tên mẫu
- Nhỏ mẫu lên gel bed
- Ly tâm ở 2800 vòng/ 2 phút - Loại bỏ cột
- Thu mẫu: dung dịch thu được sau khi ly tâm cột.
Đọc kết quả trình tự gien trên máy giải trình tự ABI 3100-AvantTM
Genetic Analyser
Thực hiện điện di trên máy giải trình tự ABI 3100-AvantTM Genetic Analyser (Applied Biosystem, Mỹ) với gel POP-6.
Chuyển toàn bộ dung dịch sản phẩm ADN của phản ứng PCR giải trình tự gien vào từng giếng tương ứng trên đĩa chạy mẫu (sample plate).
Đặt đĩa vào máy giải trình tự ABI 3100.
Khởi động phần mềm ABI PRISM®GeneScan®Analysis phiên bản 3.7.
Hiệu chỉnh các thông số theo phần mềm trên và cài đặt các thông số cho phân tích kết quả giải trình tự. Chọn chương trình phân tích giải trình tự ADN với gel POP-6 cho độ chính xác 98.5% đoạn ADN có độ dài khoảng 650 bp. Máy giải trình tự gien có 4 mao quản với mỗi mao quản có độ dài là 50cm. Thì mỗi lần chạy đọc được 4 giếng theo chiều dọc của đĩa từ A đến H và mất 2 giờ 30 phút cho mỗi lần chạy.
Trình tự nucleotide được phân tích theo các thông số của phần mềm đi kèm theo máy giải trình tự (chất lượng đọc các nucleotide, phát hiện SNP là trạng thái đa dạng kiểu nucleotide tại một vị trí trên gien...)
b/ Xác định týp vi rút dại
Sử dụng các phần mềm tin-sinh học trong nghiên cứu, bao gồm các chương trình Chromas, BioEdit, Lasergene, và MEGA4.0, để thu nhận, xử lý, phân tích các chuỗi nucleotide, axit amin và các đặc điểm sinh học phân tử gien N của vi rút dại và xây dựng mối quan hệ phả hệ định týp các chủng vi rút dại phân lập tại Việt Nam.
Các chủng vi rút dại thuộc đại diện cho các genotype khác nhau như chủng PV (Pasteur Virus) và CVS (chủng vi rút thử thách) thuộc genotype 1, chủng vi rút dơi Lagos thuộc genotype 2, chủng vi rút Mokola thuộc genotype 3, chủng vi rút Duvenhage thuộc genotype 4, chủng vi rút European bat
lyssavirus 1 thuộc genotype 5, chủng vi rút European bat lyssavirus 2 thuộc genotype 6 và chủng vi rút Australian bat lyssavirus thuộc genotype 7 được sử dụng làm đại diện để xác định týp của các chủng vi rút dại phân lập tại Việt Nam.
Xử lý chuỗi ADN bằng chương trình Chromas: Chromas (ChromasLite) là một chương trình nổi (interface application) của máy tính PC được dùng để mở file ở dạng .ab1 hoặc .scf (giản đồ đồ thị) của các chuỗi giải trình tự, do máy giải trình tự tự động của hãng ABI, Amersham MegaBace, ALF, Beckman CEQ 2000XL và CEQ 8000. Chương trình này cho phép xuất chuỗi nucleotide ra ở dạng chữ (.txt), chuyển đổi nucleotide sang amino acid, thu nhận hình ảnh giải trình và nhiều ứng dụng khác. Chromas 2.13 hay ChromasLite được cung cấp tại website: http://www.technelysium.com.au/chromas.html.
Phân tích di truyền tiến hóa phân tử và xác định týp của các chủng vi rút dại bằng phần mềm MEGA: MEGA (Molecular Evolutionary Gentics Analysis) là một hệ chương trình nổi được lập trình dễ sử dụng với mục đích so sánh đối
chiếu các chuỗi gien đồng chức năng từ các chủng cùng loài, từ các chủng khác loài trong cùng giống/chi thuộc cùng một họ. MEGA so sánh và sắp xếp đa trình tự nucleotide đoạn gien N 500 nucleotide của các chủng vi rút dại trong nghiên cứu này, kết quả của quá trình này là cơ sở để xây dựng cây phả hệ và xác định genotype của các chủng vi rút dại phân lập tại Việt Nam. Chương trình MEGA4.0 được cung cấp miễn phí và là các chương trình phân tích phả hệ tiến hóa có giá trị (http://www.megasoftware.net/). Cây phả hệ giữa các chủng của Việt Nam và thế giới bằng phương pháp kết nối liền kề (Neighbour -Joining) với giá trị tính phần trăm sự lặp lại (giá trị tin cậy) có độ tin cậy tại mỗi nhánh phát sinh là 1000 lần (giá trị bootstrap).
2.3.2. Phân tích đặc điểm phân tử nucleoprotein
Một đoạn gien N khoảng 500 nucleotide được dùng để phân tích đặc điểm nucleoprotein về sự đồng nhất nucleotide và axit amin của các chủng vi rút dại phân lập tại Việt Nam với các chủng vi rút dại phân lập tại các nước Châu Á như Thái Lan, Philippine, Trung Quốc, Nepal...
Số liệu được làm sạch bằng phần mềm MEGA, sau đó được dùng phương pháp ClustalW để sắp xếp đa trình tự.
Các chuỗi nucleotide hay axit amin được sắp xếp và tính toán mức độ đồng nhất (identity) và tương đồng (homology) bằng chương trình Lasergene (Germany).
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả xác định và định týp vi rút dại lƣu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2006 - 2012
3.1.1. Kết quả xác định vi rút dại lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2006-2012
3.1.1.1. Kết quả chẩn đoán xác định bệnh dại trên ngƣời
a. Kết quả thu thập và chẩn đoán các mẫu bệnh phẩm lâm sàng của bệnh nhân nghi dại
Trong tổng số 63 bệnh nhân nghi dại điều trị tại viện Các bệnh truyền nhiễm và