3.1.1.1. Kết quả chẩn đoán xác định bệnh dại trên ngƣời
a. Kết quả thu thập và chẩn đoán các mẫu bệnh phẩm lâm sàng của bệnh nhân nghi dại
Trong tổng số 63 bệnh nhân nghi dại điều trị tại viện Các bệnh truyền nhiễm và nhiệt đới Quốc gia và bệnh viện Bạch Mai thu thập được 102 mẫu bệnh phẩm. Trong đó có 14 bệnh nhân chỉ thu thập được dịch não tủy (DNT), 8 bệnh nhân lấy được nước bọt (NB) và 41 bệnh nhân có đầy đủ cả dịch não tủy và nước bọt. Kiểm tra sự có mặt ARN của vi rút dại trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng bằng kỹ thuật RT – PCR đã khẳng định 29/63 bệnh nhân bị nhiễm vi rút dại, tỷ lệ dương tính với vi rút dại là 46,03%.
Bảng 3.1 Kết quả chẩn đoán bệnh dại trên ngƣời bằng kỹ thuật RT – PCR
Mẫu bệnh phẩm Kết quả RT-PCR Tổng cộng Dƣơng tính Âm tính Dịch não tủy 4 10 14 Nước bọt 7 1 8
Dịch não tủy và nước bọt 18 23 41
Kết quả chạy điện di 1 2 3 4 5 6 7 8 Sơ đồ điện di 2000 750 500 250 100 Giếng 1: Marker Giếng 2: Mẫu bệnh phẩm NB 20 (+) Giếng 3: Mẫu bệnh phẩm DNT 20 (+) Giếng 4: Mẫu bệnh phẩm DNT 21 (+) Giếng 6: Chứng dương Giếng 8: Chứng âm
Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng
Trước đây, các kỹ thuật chẩn đoán bệnh dại intra vitam (khi bệnh nhân vẫn còn sống) sử dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (FA) để xác định kháng nguyên vi rút dại trong mẫu bệnh phẩm phết giác mạc, phân lập vi rút trong nước bọt, dịch não tủy và xác định kháng thể kháng dại trong huyết thanh và dịch não tuỷ của bệnh nhân. Cả ba kỹ thuật này đều có độ nhạy thấp, đặc biệt là kỹ thuật xác định kháng thể kháng dại trong huyết thanh thường không thể ứng dụng cho bệnh nhân đã tiêm phòng vắc xin dại. Ngày nay với tiến bộ khoa học kỹ thuật và những nghiên cứu sâu về đặc điểm cấu trúc genome của vi rút dại, người ta đã phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử, có độ nhạy và đặc hiệu cao cho phép chúng ta chẩn đoán sớm bệnh dại ở người và động vật. Các nghiên cứu đã cho thấy, kỹ thuật RT – PCR, PCR tổ, Real time - PCR chẩn đoán bệnh dại trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng là nước bọt và dịch não tuỷ của bệnh nhân nghi dại thì có thể phát hiện được 98% - 100% [2]. Việc chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh dại ở động vật giúp cho việc xử lý kịp thời ổ dịch dại ở động vật và điều trị dự phòng cho bệnh nhân bị phơi nhiễm với vi rút dại, và đặc biệt việc chẩn đoán xác định bệnh dại ở người giúp các nhà lâm sàng có các biện pháp cách ly bệnh nhân, tiêm phòng cho cán bộ y tế và người nhà chăm sóc bệnh nhân tránh lây lan bệnh dại cho cộng đồng.
Trên thế giới, người ta thường ứng dụng gien N và gien P để chẩn đoán vi rút dại trong các mẫu bệnh phẩm bằng các kỹ thuật sinh học phân tử qua việc sử dụng đoạn
mồi đặc hiệu để khuếch đại gien N và gen P. Tuy nhiên, gien N được ứng dụng trong chẩn đoán rộng rãi hơn do gien N là một trong những gien có mức độ bảo tồn cao và đặc biệt hiệu quả khi nghiên cứu về kiểu gien, dịch tễ hoc phân tử, tiến hoá của vi rút dại. Các công trình nghiên cứu khoa học cho thấy khi phân tích trình tự cách quãng 200 nucleotide của gien N hoặc một đoạn gien khoảng 200 – 300 nucleotide sẽ thu được kết quả tương tự như khi phân tích toàn bộ trình tự gien N (Smith và CS, 1992; Kissi và CS, 1995; Conzelmann và CS, 1990; Bourhy và CS, 1993; Kissi và CS, 1995; Smith và CS, 1992; Nadine – David và CS, 1994; Kissi và CS, 1995; Nishizono và CS, 2002). Chính vì vậy gien N được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh dại bằng các kỹ thuật sinh học phân tử; phân loại kiểu gien (genotyping), xây dựng bản đồ dịch tễ học phân tử và nghiên cứu sự tiến hóa của vi rút dại so với các vi rút gây bệnh dại thuộc nhóm Lyssavirus [22, 23, 28, 39, 46, 51]. Trong nghiên cứu này chúng tôi áp dụng kỹ thuật RT – PCR khuyếch đại gien N để xác định vi rút dại có mặt trọng các mẫu bệnh phẩm lâm sàng của bệnh nhân và chó nghi dại. Trình tự đoạn gien N có độ dại 600 nucleotide được giải mã trực tiếp từ sản phẩm ADN được khuếch đại bằng kỹ thuật RT – PCR. Do vậy, đoạn gien phân tích đáp ứng được yêu cầu về xác định kiểu gien của vi rút dại cũng như phân tích dưới nhóm của vi rút. Gien P cũng là gien khá bảo tồn trong các gien của vi rút dại, có tới 97% sự tương đồng nucleotide của các chủng vi rút thuộc genotype 1 [46]. Vùng được bảo tồn nhất trong gien P chính là vùng ưa nước, nằm ở vị trí axit amin 139 – 170 [46] được sử dụng để thiết kế mồi cho các kỹ thuật chẩn đoán vi rút dại bằng các phương pháp sinh học phân tử và gien P cũng được sử dụng để nghiên cứu sự tiến hóa của vi rút dại trong một kiểu gien, nhưng hiệu quả phân loại kiểu gien bằng gien P tỏ ra không hiệu quả bằng gien N và phải giải trình tự toàn bộ gien P thì khả năng phân loại genotype mới chính xác.
b. Kết quả chẩn đoán bệnh nhân theo tiền sử phơi nhiễm với động vật nhiễm dại
Trong số 29 bệnh nhân dại được chẩn đoán xác định phòng thí nghiệm có 13/29 bệnh nhân bị chó cắn chiếm 45%; 7/29 bệnh nhân bị phơi nhiễm thông qua việc giết
mổ chó, mèo ốm hoặc chết chiếm 24% và có 9/29 bệnh nhân không nhớ rõ tiền sử phơi nhiễm như bị chó, mèo cắn hoặc giết mổ chó mèo, chiếm 31%.
Hình 3.2. Tiền sử phơi nhiễm của bệnh nhân dại đƣợc chẩn đoán xác định phòng thí nghiệm
Trong số 29 bệnh nhân dại được chẩn đoán khẳng đinh phòng thí nghiệm bằng kỹ thuật RT-PCR thì có tới 7/29 bệnh nhân bi mắc dại do giết mổ chó mèo bị ốm, chiếm 24%. Do đó, cần phải có những biện pháp truyền thông tới người dân, giúp cho những người làm nghề giết mổ chó tại lò mổ ý thức được việc phải tiêm phòng vắc xin dại và kiểm tra nồng độ kháng thể kháng dại định kỳ. Đồng thời khuyến cáo người dân không nên giết thịt những con chó mèo bị ốm. Ngoài ra, những người có nguy cơ phơi nhiễm cao với vi rút dại như các nhân viên y tế chăm sóc bệnh nhân dại, bác sĩ thú y, người làm việc trong các phòng thí nghiệm về dại... cần phải được tiêm phòng và có biện pháp đảm bảo an toàn khi làm việc, để giảm nguy cơ lây nhiễm bệnh.
13/29 (45%) bệnh nhân bị mắc bệnh dại do bị chó mèo cắn, cho thấy công tác phòng chống bệnh dại cần phải được chú trọng hơn trong việc quản lý và theo dõi đàn chó trong các hộ dân. Hạn chế nuôi chó, chó cần phải được tiêm phòng, chó nuôi phải xích nhốt, ra đường phải rọ mõm. Khi bị chó không rõ nguồn gốc, chó không được tiêm phòng, chó có biểu hiện ốm cắn, cần phải tiêm phòng vắc xin dại sớm và đầy đủ.
Theo báo cáo giám sát ca bệnh dại trên người của chương trình phòng chống dại Quốc Gia, 2006 – 2011 trong số các ca tử vong có chẩn đoán lâm sàng nghi dại (560 ca) có 90,2% bị chó cắn, 1,6% bị mèo cắn và 8,2% bị phơi nhiễm thông qua giết mổ chó mèo, chơi với chó hoặc chăm sóc chó (Nguyễn Thị Thanh Hương, 2012). Tỷ lệ phơi nhiễm do bị chó mèo cắn, thịt chó mèo hoặc không nhớ rõ tiền sử phơi nhiễm trong nghiên cứu này của chúng tôi khác với báo cáo của chương trình giám sát các ca bệnh dại trên người là do:
+ Số lượng bệnh nhân được chẩn đoán khẳng định phòng thí nghiệm còn hạn chế (63 trường hợp), còn rất nhiều bệnh nhân nghi dại chưa được chẩn đoán phòng thí nghiệm;
+ Số ca được chẩn đoán xác định phòng thí nghiệm chỉ là 29/63 và tập trung tại một số tỉnh miền Bắc, do vậy mẫu phân tích nhỏ chưa đại diện. Tuy nhiên việc khẳng định chẩn đoán phòng thí nghiệm ở những ca bệnh dại do phơi nhiễm với các hình thức khác nhau là bằng chứng khoa học để có những biện pháp phòng chống thích hợp;
+ Hiệu quả chẩn đoán phòng thí nghiệm sử dụng các mẫu bệnh phẩm lâm sàng còn chưa cao do chỉ lấy được mẫu 1 lần (dịch não tủy, nước bọt) và đặc tính của vi rút không đào thải thường xuyên liên tục ra nước bọt, dịch não tủy. Chưa thực hiện được chẩn đoán khẳng định sau khi bệnh nhân tử vong nghi do dại;
+ Một số bệnh nhân được chẩn đoán phòng thí nghiệm không được báo cáo ca bệnh trong chương trình giám sát do bệnh nhân vượt tuyến điều trị, không được báo cáo từ tuyến tỉnh. Do vậy, cần phải tăng cường giám sát ca bệnh trong hệ thống và thúc đẩy giám sát phòng thí nghiệm bệnh dại để có những bằng chứng chính xác góp phần xây dựng chiến lược phòng chống bệnh dại hiệu quả trong tương lai.
3.1.1.2 Kết quả chẩn đoán xác định bệnh dại ở động vật
Bảng 3.2. Kết quả chẩn đoán bệnh dại ở động vật Tình trạng sức
khỏe của chó Địa phƣơng Số mẫu chẩn đoán Dƣơng tính Tỷ lệ dƣơng tính Thu thập tại lò mổ Hà Nội 50 2 2/50 Hòa Bình 30 0 0/30 Phú Thọ 30 0 0/30 Thái Bình 30 0 0/30 Tổng 150 2 2/150 Chẩn đoán lâm sàng nghi dại Sơn La 1 1 1/1 Lào Cai 1 1 1/1 Yên Bái 4 4 4/4 Tổng 6 6 6/6
Trong 150 mẫu não chó thu thập từ các lò mổ, có 2/150 mẫu dương tính với vi rút dại được xác định bằng kỹ thuật RT – PCR, với tỷ lệ 1,33%. Cả hai mẫu bệnh phẩm này đều là chó thuộc huyện Hoài Đức và Quốc Oai, tỉnh Hà Tây cũ, nơi có tới 10 ca bệnh dại ở người đã được chẩn đoán khẳng định phòng thí nghiệm.
2/150 con chó thu thập tại lò mổ tại Hà Nội (Hà Tây cũ) được khẳng định nhiễm vi rút dại là bằng chứng đưa ra đề xuất những người làm nghề giết mổ chó, làm công tác thú y cần phải được tiêm phòng vắc xin dại. Tập quán nuôi chó thả rông ở nông thôn Việt Nam làm cho khả năng lây truyền bệnh dại ở động vật gần người như chó, mèo là rất lớn dẫn đến nguy cơ lây truyền bệnh dại cho người. Theo thống kê của cục Thú y, hiện nay cả nước có khoảng 6 – 7 triệu con chó nuôi, nhưng tỷ lệ tiêm phòng bệnh dại trung bình trên toàn quốc chỉ đạt từ 15 – 30%, có những nơi không thực hiện tiêm phòng cho chó mèo [1, 3].
Kết quả trên cũng giải thích một cách khoa học về tình hình bệnh dại ở người tại Hà Tây đang là vấn đề nổi cộm. Trong 148 mẫu bệnh phẩm não chó âm tính, chó đều có một trong các biểu hiện như bỏ ăn, kích thích, chảy nhiều nước dãi. Điều đó
cho thấy bệnh cảnh lâm sàng của bệnh dại ở động vật cũng rất dễ nhầm với các bệnh khác. Vì vậy, việc chẩn đoán sớm, chính xác bệnh dại trên động vật có ý nghĩa rất quan trọng trong công tác dự phòng sự lan truyền bệnh dại từ động vật sang người. Việc chẩn đoán bệnh dại ở động vật còn có ý nghĩa thực tế trong vấn đề điều trị dự phòng bằng vắc xin và kháng huyết thanh dại cho những người bị chó nghi dại cắn. Đặc biệt, giúp cho có những chỉ định đúng đắn về tiêm huyết thanh kháng dại, tiêm phòng trước phơi nhiễm (PEP - Pre Exposure Phylaxis) cho các đối tượng nguy cơ cao ở trong vùng có bệnh dại ở động vật gần người lưu hành, tránh lạm dụng việc sử dụng huyết thanh kháng dại [4, 20].
Với kết quả 2/ 150 mẫu dương tính của chó tại lò mổ là lời cảnh báo cho các chủ lò mổ tại Hà Tây nói riêng và trên cả nước nói chung phải lựa chọn chó khoẻ mạnh, đồng thời phải có các biện pháp phòng bệnh cho người làm việc tại các lò mổ và xử lý chất thải của lò mổ để tránh lây nhiễm cho người và vật nuôi cũng như môi trường xung quanh.
6 con chó được chẩn đoán lâm sàng bệnh dại thu thập tại các tỉnh Sơn La, Lào Cai và Yên Bái được gửi đến Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương để chẩn đoán phòng thí nghiệm. Kết quả 6/6 con chó đã được chẩn đoán xác định nhiễm vi rút dại bằng kỹ thuật RT – PCR. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
6/6 mẫu bệnh phẩm từ chó nghi dại tại các tỉnh miền núi phía Bắc là Sơn La, Lào Cai, Yên Bái dương tính với vi rút dại chứng tỏ bệnh dại trên động vật đang lưu hành ở miền Bắc với tập tính nuôi chó thả rông, không có đăng ký quản lý đàn chó và không tiêm phòng vắc xin cho chó thì nguy cơ nhiễm dại cho các đàn chó trên khu vực toàn quốc là rất lớn. Đặc biệt, một trong 6 con chó được chẩn đoán dương tính là chó tại tỉnh Yên Bái đã được tiêm phòng vắc xin trước đó 6 tháng. Do vậy, cần phải đánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc xin cũng như quy trình tiêm vắc xin cho chó tại Việt Nam. Hơn thế nữa chúng ta vẫn chưa có chính sách rõ ràng và thực hiện nghiêm túc việc quản lý và kiểm dịch động vật, điều đó cảnh báo nguy cơ nhiễm dại ở động vật và lây lan sang người là rất lớn và diễn biến phức tạp.
3.1.1.3 Sự phân bố các chủng vi rút dại lƣu hành tại miền Bắc Việt Nam theo địa dƣ
Bảng 3.3 cho thấy bệnh dại lưu hành ở nhiều vùng địa lý khác nhau, tập trung chủ yếu ở các tỉnh miền núi, trung du. Đặc biệt tỷ lệ bệnh nhân mắc dại ở Hà Tây và Phú Thọ cao hơn các tỉnh khác thuộc khu vực miền Bắc, đây là hai tỉnh nổi trội về tình hình bệnh dại trên người trong những năm gần đây ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam.
Bảng 3.3. Các chủng vi rút dại lƣu hành tại miền BắcViệt Nam theo địa dƣ từ 2006-2012 Loài mắc Nơi phân lập Tiền sử phơi nhiễm/
triệu chứng Ký hiệu chủng Năm phân lập Số đăng ký tại ngân hàng gien Người Hà Nội (Hà Tây cũ) Chó cắn H010607 2007 AB614379 Giết mổ chó H020607 2007 AB628214 Chó cắn H040707 2007 AB614380 Chó cắn H111007 2007 AB614385 Giết mổ chó H140208 2008 AB614387 H200608 2008 AB614390 Không rõ H240808 2008 AB614392 Giết mổ chó H280509 2009 AB614393 Không rõ H350110 2010 - H450710 2010 -
Hòa Bình Không rõ H170408 2008 AB614389
Lạng Sơn Ăn thịt chó H130108 2008 AB614386
Yên Bái Giết mổ chó H050707 2007 AB614381
Phú Thọ
Chó cắn H060907 2007 AB628212
H071007 2007 AB614382
Giết mổ chó H091007 2007 AB614384
Loài mắc Nơi phân lập Tiền sử phơi nhiễm/
triệu chứng Ký hiệu chủng Năm phân lập Số đăng ký tại ngân hàng gien
H370210 2010 -
Phú Thọ Không rõ H430710 2010 -
Chó cắn H610512 2012 -
Sơn La Không rõ H080807 2007 AB614383
Thái Bình Không rõ H501110 2010 -
Tuyên Quang Không rõ H150308 2008 AB614388
Chó
Hà Tây cũ – Hà Nội Thu thập từ các lò mổ D010807 2007 AB614372
D060807 2007 AB628210
Sơn La Hung dữ và tấn công người D1590411 2011 -
Lào Cai Hung dữ và tấn công người D1600611 2011 -
Yên Bái Hung dữ và tấn công người
D1700712 2012 -
D1710712 2012 -
D1720712 2012 -
Hình 3.3. Bản đồ lƣu hành các chủng vi rút dại phân lập ở chó và ngƣời thuộc các tỉnh phía Bắc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.3 và hình 3.3 cho thấy 31 chủng vi rút dại xác định được trên người (23 chủng) và chó (8 chủng) tại miền Bắc, chủ yếu tập trung ở các tỉnh Hà Nội, Phú Thọ, Hòa Bình, Yên Bái, Sơn La, Lào Cai, Tuyên Quang.
Kết quả chẩn đoán phòng thí nghiệm vi rút dại trên người và động vật cho