III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn
2.3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy
năng tạo sẹo từ cây mầm
Điều kiện thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện chiếu sáng 16/8h. Cây mầm được đặt vào môi trường MS1, MS2, MS3 với thành phần khác nhau về nồng độ vi lượng và đa lượng, có hay không có nước dừa như bảng 2.1. Sử dụng chất ĐHST thực vật là NAA 2mg/l kết hợp với TDZ từ 0,5 đến 2 mg/l như bảng 2.3.
Bảng 2.3. Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy trong cảm ứng tạo mô sẹo
Nồng độ chất ĐHST(mg/l) Môi trường nuôi cấy
NAA TDZ MS1 MS2 MS3 2 0,5 1 1,5 2
2.3.2.3. Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA lên khả năng tạo sẹo
Điều kiện thí nghiệm: NAA ở các nồng độ từ 0,5 - 3 mg/l kết hợp với BA ở các nồng độ 0,5 - 1,5mg/l theo bảng 2.4 được bổ sung vào môi trường MS2 để khảo sát khả năng tạo sẹo của cây mầm.
Bảng 2.4. Ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng tạo sẹo Nồng độ chất ĐHST(mg/l) NAA BA 0,5 2 3 0,5 1 1,5
2.3.3. Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo
Vật liệu: Mô sẹo có khả năng tạo chồi ở thí nghiệm 1 được tách nhỏ với kích thước 0,5 x 0,5 cm.
Điều kiện thí nghiệm: Sử dụng TDZ, NAA hay 2,4-D ở nồng độ 0 - 0,1 mg/l trên môi trường MS1 để khảo sát sự biệt hóa chồi từ mô sẹo. Mỗi nghiệm thức sử dụng 10 mẫu. Lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ mô sẹo sống sót, tỉ lệ mô sẹo hình thành chồi và khả năng tạo chồi trên mỗi cụm mô sẹo.
2.3.4. Nghiên cứu nhân nhanh tạo cụm chồi từ chồi phát sinh từ mô sẹo
Vật liệu: Các chồi cao từ 2 cm trong thí nghiệm 2 được cắt bỏ lá, phần thân còn lại được cắt thành đoạn dài 0,5 cm, đặt nằm ngang trên môi trường 1/2MS (thành phần môi trường MS giảm một nữa đa lượng và vi lượng) để cảm ứng tạo chồi.
Điều kiện thí nghiệm: BA ở các nồng độ 0 - 2 mg/l được bổ sung vào môi trường 1/2MS để cảm ứng tạo chồi. Mỗi nghiệm thức sử dụng 10 đoạn chồi nhỏ, lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng chồi và chiều cao chồi tính từ gốc đến đỉnh ngọn chồi trên một mẫu sau 2 tháng nuôi cấy.
2.3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ĐHST thực vật lên khả năng tăng trưởng của chồi Tràm ta.
Vật liệu: Cụm chồi ở thí nghiệm 3 được cắt thành cụm nhỏ hơn (0,5 x 0,5 cm) đặt vào môi trường 1/2MS có bổ sung các chất ĐHST thực vật.
Điều kiện thí nghiệm: Môi trường 1/2MS bổ sung các chất ĐHST thực vật GA3, BA, IAA với nồng độ được bố trí như bảng 2.5 để khảo sát khả năng kéo dài chồi. Mỗi nghiệm thức sử dụng 10 mẫu, lặp lại 3 lần.
Bảng 2.5. Ảnh hưởng của chất ĐHST lên khả năng kéo dài chồi
Nồng độ chất ĐHST(mg/l) GA3 BA IAA 0 0 0 0.3 0 0 0.5 0 0 1 0 0 0.5 0.3 0 0.5 0.5 0 0.5 0 0.3 0.5 0 0.5 0.5 0.3 0.3
Chỉ tiêu theo dõi: Số chồi có chiều cao trên 1 cm tính từ gốc đến đỉnh chồi sau 2 tuần nuôi cấy, số chồi có chiều cao trên 1 cm và chiều cao chồi sau 4 tuần nuôi cấy.
2.3.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của các auxin khác nhau ở nồng độ khác nhau lên khả năng ra rễ in vitro của cây Tràm ta.
Vật liệu: Chồi khi đạt được chiều dài hơn 2 cm trong thí nghiệm 4
Điều kiện thí nghiệm: Sử dụng môi trường 1/2MS có bổ sung NAA hoặc IBA ở các nồng độ 0 - 2 mg/l để khảo sát khả năng tạo rễ in vitro ở chồi Tràm ta. Mỗi nghiệm thức sử dụng 10 mẫu, lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ mẫu tạo rễ, số lượng rễ và chiều dài rễ tính từ gốc đến đỉnh ngọn rễ dài nhất và ngắn nhất trên mẫu cấy.
2.3.7. Nghiên cứu khả năng thích nghi của cây Tràm ta in vitro trong điều kiện vườn ươm.
Điều kiện thí nghiệm: Cho bình nuôi cấy có chứa mẫu ở thí nghiệm 5 thích nghi với điều kiện vườn ươm trong vòng 1 tuần rồi cấy vào bầu đất. 100 cây con in vitrocó đầy đủ rễ được cấy vào bầu đất với tỉ lệ xơ dừa và đất là 1:1.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ cây con khỏe mạnh, hình dạng cây, tốc độ phát triển của cây sau khi đưa ra vườn ươm.
2.4. XỬ LÝ THỐNG KÊ
Số liệu trong các bảng kết quả được phân tích thống kê nhờ chương trình Statistical Program Scientific System (SPSS) phiên bản 16.0 cho windows. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức xác suất 0,05 của các giá trị được thể hiện bởi các chữ số khác nhau kèm theo.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA SỰ KẾT HỢP AUXIN VÀ CYTOKININ, THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG LÊN KHẢ NĂNG TẠO SẸO TỪ CÂY MẦM
3.1.1. Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và cytokinin lên khả năng tạo sẹo từ cây mầm
Khả năng khởi phát tạo mô sẹo phụ thuộc vào nồng độ riêng lẻ của auxin hay đôi khi có sự kết hợp với cytokinin. Auxin kích thích mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng (tầng phát sinh libe - mộc), nhưng hầu như không tác động trên mô phân sinh sơ cấp. Còn cytokinin lại làm tăng khả năng phân chia của các tế bào mô sẹo (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2002).
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và TDZ trong cảm ứng tạo mô sẹo
Chất ĐHST (mg/l)
Tỉ lệ sẹo có khả năng tạo chồi sau 3 tháng nuôi cấy (%)
NAA
TDZ 0 0,5 1 2 3
0 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a
0,5 93,2 ± 3,3op 78,3 ± 5,4lmno 58,3 ± 6,4fghijk 56,6 ± 6,5fghij 66,6 ± 6,1hijklmn
1 96,6 ± 2,3p 66,6 ± 6,1hijklmn 48,3 ± 6,5defg 70,0 ± 6,0ijklmn 61,6 ± 6,3ghijkl
1,5 91,6 ± 3,6op 83,3 ± 4,9nop 63,3 ± 6,3ghijkl 75,0 ± 5,6klmn 71,6 ± 5,9jklmn
2 81,6 ± 5,0mnop 65,0 ± 6,2ghijklm 36,6 ± 6,3bcde 53,3 ± 6,5fghi 33,3 ± 6,1bcd
3 71,6 ± 5,9jklmn 64,0 ± 5,8ghijklm 41,6 ± 6,4cdef 61,6 ± 6,3ghijkl 26,6 ± 5,8bc
5 70,9 ± 4,2jklmn 51,6 ± 6,5efgh 28,3 ± 5,9bc 35,0 ± 6,2bcd 21,6 ± 5,4b
Các số trung bình trong bảng với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%.
Trong thí nghiệm này, các nghiệm thức sử dụng NAA riêng lẻ, cây mầm hình thành rễ sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường cảm ứng, mô sẹo hình thành ở vết cắt và thân mầm nhưng sau đó sẹo trở nên nâu đậm và chết (hình 3.1). Cho thấy NAA riêng lẻ không thích hợp cho khả năng cảm ứng tạo sẹo từ cây mầm Tràm ta. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Anna và cộng sự năm 2007 trên đối tượng Melaleuca afternifolia.
NAA 0,5 mg/l
NAA 1 mg/l
NAA 2 mg/l NAA 3 mg/l
Hình 3.1. Cảm ứng tạo mô sẹo từ cây mầm Tràm ta ở nồng độ NAA từ 0,5 đến 3 mg/l sau 3 tháng nuôi cấy
TDZ là chất ĐHST thực vật thích hợp cho khả năng tạo sẹo và phát sinh cơ quan đối với nhiều loài cây thân gỗ kể cả Tràm ta. Khi sử dụng môi trường MS có bổ sung nước dừa và casein thủy phân kết hợp với TDZ nồng độ từ 0 đến 1,5 mg/l, sau 2 tuần nuôi cấy cây mầm phình lên ở phần chồi và phần vết cắt. Sau 2 tháng nuôi cấy, cụm mô sẹo trở nên to, xanh, đặc và phát sinh chồi trên bề mặt mô sẹo trong cùng môi trường nuôi cấy (hình 3.2). Trong đó, nghiệm thức TDZ 1 mg/l cho tỉ lệ sẹo tạo chồi cao nhất (96,6 ± 2,33). Nồng độ TDZ từ 2 đến 5 mg/l khối sẹo tạo thành là những nốt to, xanh nhạt hơn và đặc (hình 3.2). Khả năng cảm ứng tạo chồi từ những khối sẹo này thấp. Có thể do nồng độ TDZ quá cao làm ức chế khả năng tạo sẹo từ cây mầm Tràm ta.
TDZ 0,5 mg/l TDZ 1 mg/l
TDZ 1,5 mg/l TDZ 2 mg/l
TDZ 3 mg/l TDZ 5 mg/l
Hình 3.2. Cảm ứng tạo mô sẹo từ cây mầm Tràm ta với TDZ từ 0,5 đến 5 mg/l sau 3 tháng nuôi cấy
Ở các nghiệm thức TDZ kết hợp với NAA cho tỉ lệ tạo sẹo thấp hơn (bảng 3.1) và cấu trúc mô sẹo cũng khác so với môi trường chỉ chứa TDZ. Ở các nghiệm thức với nồng độ NAA từ 0,5 đến 1 mg/l phần chồi mầm phình lên và hình thành chồi trên cùng môi trường sau 2 tháng nuôi cấy. Tuy nhiên, cụm chồi này nhỏ hơn
so với cụm chồi hình thành từ nghiệm thức chỉ chứa TDZ. Phần vết cắt cho khối mô sẹo nhỏ, bở, xanh nhạt và mọng nước. Sau 2 tháng cụm sẹo này hóa đen (hình 3.3).
NAA 0,5 mg/l + TDZ 1,5 mg/l NAA 0,5mg/l + TDZ 1,5 mg/l (10X) NAA 1 mg/l + TDZ 1,5 mg/l NAA 1 mg/l + TDZ 1,5 mg/l (10X) NAA 2 mg/l + TDZ 1,5mg/l NAA 2mg/l + TDZ 1,5 mg/l (10X)
Hình 3.3. Cảm ứng tạo mô sẹo từ cây mầm Tràm ta ở NAA 0,5 đến 2 mg/l kết hợp với TDZ 1,5 mg/l sau 3 tháng
Khi tăng nồng độ NAA từ 2 đến 3 mg/l kết hợp với TDZ, các nghiệm thức cho cấu trúc mô sẹo khác với các nghiệm thức chỉ sử dụng TDZ hay các nghiệm
thức kết hợp giữa NAA 0,5 và 1 mg/l và TDZ. Nghiệm thức NAA 2 mg/l kết hợp với TDZ từ 0,5 đến 1,5 mg/l cho khối sẹo to, xanh nhạt, bở, phát sinh trên cả phần thân mầm và chồi mầm. Sau 3 tháng nuôi cấy, khối mô sẹo trở nên xanh đậm và chắc (hình 3.3).
Auxin có tác dụng khởi phát quá trình tạo mô sẹo, còn cytokinin lại làm tăng khả năng phân chia của các tế bào mô sẹo (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2002). Cytokinin kích thích sự tăng trưởng tế bào với điều kiện có auxin (Bùi Trang Việt, 2000). Do đó, trong thí nghiệm này, khi có sự kết hợp giữa auxin và cytokinin là NAA và TDZ - có bản chất cytokinin, thì mô sẹo hình thành và tiếp tục tăng trưởng kích thước trong 3 tháng nuôi cấy. Không thấy có sự biệt hóa chồi trên cụm mô sẹo như trong môi trường có bổ sung NAA từ 0 đến 1 mg/l kết hợp với TDZ.
NAA 3 mg/l + TDZ 1,5 mg/l NAA 3 mg/l + TDZ 2 mg/l
NAA 3 mg/l + TDZ 3 mg/l NAA 3 mg/l + TDZ 5 mg/l
Hình 3.4. Cảm ứng tạo mô sẹo từ cây mầm Tràm ta ở nồng độ NAA 3 mg/l kết hợp với TDZ từ 1,5 đến 5 mg/l sau 3 tháng
Nồng độ NAA 3 mg/l kết hợp với TDZ từ 2 đến 5 mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo sẹo giảm dần (bảng 3.1). Những mô sẹo lúc đầu to, đặc nhưng sau đó hóa nâu và chết
(hình 3.4). Điều này có thể do nồng độ các chất điều hòa tăng trưởng thực vật càng cao sẽ ức chế khả năng cảm ứng hình thành mô sẹo hoặc kích thích sự phát triển các mô sẹo không có khả năng tái sinh (Nguyễn Quang Thạch, 2009).
3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy lên khả năng tạo sẹo từ cây mầm
Trong điều kiện tự nhiên, cây Tràm có thể sống tốt ở nhiều điều kiện khắc nghiệt, nghèo chất dinh dưỡng. Do đó, khi giảm thành phần khoáng đa lượng và vi lượng của môi trường MS - thuộc nhóm môi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng thích hợp cho đa số các loài cây trồng in-vitro, khối mô vẫn cảm ứng tốt và cho khả năng sinh trưởng và phát triển cao.
Ở các nghiệm thức trong thí nghiệm này, thành phần môi trường MS2 chứa NAA 2 mg/l kết hợp với TDZ 0.5 đến 2 mg/l cho khả năng tạo sẹo cao hơn với môi trường MS1 và MS3 ở cùng nồng độ chất ĐHST thực vật (hình 3.5). Điều này chứng tỏ MS2 thích hợp nhất cho khả năng tạo sẹo từ cây mầm.
Hình 3.5. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng tạo sẹo
So với các nghiệm thức ở môi trường MS1 thì những mô sẹo hình thành từ các nghiệm thức ở môi trường MS2 cho khối sẹo to, xanh và chắc sau 3 tháng nuôi cấy. Trong khi môi trường MS1, khối sẹo to, xanh nhưng dễ hóa đen sau 3 tháng nuôi cấy.
Môi trường MS3 không có nước dừa, mặc dù thời gian cảm ứng tạo mô sẹo giống như MS1 và MS2. Tuy nhiên, sau 1 tháng nuôi cấy, cụm sẹo xuất hiện với màu vàng hoặc xanh nhạt, xốp. Sau 2 tháng nuôi cấy, cụm sẹo hóa nâu đen (hình 3.6).
MS1 MS2 MS3
Hình 3.6. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng tạo sẹo từ mầm sau 3 tháng với NAA 2 + TDZ 1,5 mg/l
Cho thấy, thành phần các chất có trong nước dừa có khả năng ngăn cản lão hóa và duy trì mô sẹo trong thời gian dài và hàm lượng chất khoáng trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến khả năng duy trì mô sẹo từ cây mầm Tràm ta. Công dụng của nước dừa cũng được thừa nhận như là một chất bổ sung vào môi trường để kích thích tăng trưởng hoặc phát sinh hình thái, làm chậm quá trình lão hóa của mô thực vật in vitro. Ngoài ra,nó còn có vai trò trong việc kích thích hình thành mô sẹo cũng như phát sinh hình thái từ mô sẹo (Yong và cộng sự, 2009).
3.1.3. Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA lên khả năng tạo sẹo từ cây mầm
Mặc dù sự kết hợp giữa một auxin và một cytokinin là thích hợp cho khả năng tạo sẹo ở các loài cây thân gỗ. Và TDZ được xem là một cytokinin thích hợp cho khả năng tạo sẹo và cảm ứng phát sinh hình thái chồi từ mô sẹo ở các loài cây thân gỗ kể cả cây Tràm ta như trong thí nghiệm trên.
Trong thí nghiệm này, BA - một cytokinin thông dụng, giá thành thấp được sử dụng thay thế cho TDZ trong sự kết hợp với một auxin là NAA để xem khảo sát khả năng cảm ứng tạo sẹo từ cây mầm Tràm ta trên môi trường MS2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA trong cảm ứng tạo mô sẹo Chất đhtt (mg/l) Tỉ lệ sẹo từ cây mầm (%) NAA BA 0,5 2 3 0,5 60,0 ± 6,4c 80,0 ± 5,2d 53,3 ± 6,5bc 1 61,6 ± 6,3c 40,0 ± 6,4ab 55,0 ± 6,5bc 1,5 65,0 ± 6,2cd 30,0 ± 6,0a 26,6 ± 5,8a
Các số trung bình trong bảng với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%.
NAA 0,5 - BA 0,5 (mg/l) NAA 0,5 - BA 1 (mg/l) NAA 0,5 - BA 1,5 (mg/l) NAA 2 – BA 0,5 (mg/l) NAA 2 - BA 1 (mg/l) NAA 2 - BA 1,5 (mg/l) NAA 3 - BA 0,5 (mg/l) NAA 3 - BA 1 (mg/l) NAA 3 - BA 1,5 (mg/l)
Hình 3.7. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với BA trong cảm ứng tạo sẹo
Tương tự như TDZ, BA cũng có khả năng cảm ứng tạo sẹo từ cây mầm Tràm ta. Nghiệm thức NAA 2 mg/l kết hợp với BA 0,5 mg/l cho tỉ lệ mô cấy cảm ứng tạo
sẹo cao nhất (bảng 3.2). Những cụm sẹo này xanh, đặc và trong. Ở nồng độ NAA 0,5 mg/l kết hợp với BA 0,5 đến 1,5 mg/l, phần chồi mầm cảm ứng sau 2 tuần nuôi cấy và bắt đầu hình thành cụm chồi sau 2 tháng , phần thân mầm phình lên tạo cụm mô sẹo xanh, bở, mọng nước và hóa đen sau đó (hình 3.7).
Nồng độ cao NAA kết hợp với BA cho tỉ lệ mô cấy tạo sẹo thấp, những sẹo này hóa đen và chết sau 3 tháng nuôi cấy (hình 3.7).
Môi trường 1/2MS kết hợp với nước dừa và casein thủy phân, khi bổ sung thêm BA 0,5 mg/l kết hợp với NAA 0,5mg/l thích hợp cho khả năng tạo chồi từ cây mầm của cây Tràm ta. Số chồi hình thành từ 8 đến 10 chồi trên một cụm mô. Những cụm chồi này được tách riêng và chuyển sang môi trường 1/2MS để tiếp tục kéo dài. Sau 2 tháng nuôi cấy, cụm chồi phát triển tốt cao từ 1,5 đến 2 cm, lá xanh đậm và một số chồi xuất hiện rễ.
So với những cụm chồi xuất hiện trên cụm sẹo ở môi trường MS1 có bổ sung TDZ 0,5 đến 2 mg/l sau khi tách riêng và cấy chuyền sang môi trường 1/2MS thì các cụm chồi cảm ứng với BA 0,5 mg/l kết hợp với NAA 0,5 mg/l cho khả năng kéo dài nhanh hơn. Có thể do ảnh hưởng của TDZ làm cản trở quá trình kéo dài