IX – Cỏc phương phỏp ủỏnh giỏ hiệu quả tiờm phũng vacxin cỳm gia cầm
2.3.3.Phương phỏp H
a. Nguyờn lý: Phỏt hiện sự ức chế hiện tượng ngưng kết hồng cầu. Sử
dụng ủể giỏm ủịnh virus sau khi phõn lập và ủể ủỏnh giỏ hiệu lực văcxin sau tiờm phũng
b. Nguyờn liệu:
- Khỏng nguyờn, huyết thanh chuẩn - Bộ dụng cụ (giống HA) - ðĩa ngưng kết 96 giếng - PBS pH 7,2 - Dung dịch hồng cầu gà 0,5-1% c. Cỏch tiến hành: - Nhỏ 25 àl PBS vào cỏc giếng của ủĩa 96 giếng
- Nhỏ 25 àl huyết thanh vào giếng ủầu, tiếp tục pha loóng theo cơ số 2, giếng cuối khụng cú khỏng nguyờn
- Nhỏ 25 àl khỏng nguyờn ủó pha 4HA (hoặc 8HA) vào cỏc giếng trừ
- Nhỏ 25 àl dung dịch hồng cầu gà, ủể 30 phỳt ở nhiệt ủộ phũng
- Quan sỏt hiện tượng ngưng kết, nếu khụng cú ngưng kết hồng cầu sẽ
lắng xuống ủỏy giếng thành chấm trũn
Kết quả phản ứng HI
2.3.4. Ph−ơng pháp nhân gien sao mã ng−ợc (RT-PCR)hoặc Real Time- PCR.
a. Nguyên lý: Phát hiện và định l−ợng sự tích luỹ DNA khuyếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra.
- Khả năng phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang(PROBE). Khi tăng l−ợng DNA tỷ lệ với tăng l−ợng tín hiệu huỳnh quang.
- Những hoá chất phát quang thuốc nhuộm liên kết DNA và trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là PROBE.
- Kết quả RT-PCR là định tính (hiện diện hay vắng mặt trình tự DNA),hay định l−ợng (số bản sao DNA)
b. Chuẩn bị dụng cụ và hoá chất - Tube epp endorf mới
- Tube RT-PCR bead - Mẫu ARN
- Primers
- N−ớc đá khử ARNase - Pipette và đầu típ có lọc
c. Các b−ớc tiến hành
B−ớc 1: Chiết tách RNA của virus bằng kit QIAgen hoặc bằng TRIZOL B−ớc 2: Pha n−ớc đR khử ARNase + Primers + RNA cho vào máy chạy PCR B−ớc 3: Đọc kết quả bằng máy RT-PCR