chuột [5, 20, 62]
2.4.6.1. Phương pháp phân lập và nhân nuôi trực tiếp tế bào gan chuột
Chuột BALB/c khoẻ mạnh được sử dụng để tách tế bào tế bào gan. Khử trùng và giết chết chuột bằng cồn 70oC, tách lấy gan. Rửa gan bằng dung dịch PBS có 10% kháng sinh. Dùng panh, kéo, kim tiêm gạt, tách tế bào gan trong PBS. Thu dịch có tế bào gan, li
OD(đối chứng) - OD(chất thử) OD(đối chứng)
42
tâm, loại bỏ dịch nổi. Hoà cặn tế bào trong NH4Cl, li tâm thu cặn tế bào, cho môi trường MEME có 10% FBS và các thành phần cần thiết khác. Nuôi trong tủấm ở 37oC, 5%CO2.
2.4.6.2. Phép thử sinh học kiểm tra khả năng chống oxy hoá của hoạt chất trên tế
bào gan
- Tế bào gan sau phân lập được nuôi ổn định 1-2 ngày, sau đó đưa vào đĩa 96 giếng với mật độ 1 x 104 tế bào/giếng, nuôi qua đêm trong tủấm 5% CO2, ở 37oC.
- Thêm hoạt chất nghiên cứu hoặc cucurmin (đối chứng dương) ở các nồng độ khác nhau, ủ trong 2 giờ.
- Thêm 100 µM H2O2 vào mỗi giếng, ủ trong 2 giờ. - Cho 50 µl/giếng MTT nồng độ 1mg/ml, ủ trong 4 giờ. - Loại bỏ dịch nổi, thêm vào mỗi giếng 100 µl DMSO 100%. - Đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 492 nm.
- Tính kết quả:
Giá trị ED50 (nồng độ bảo vệđược 50% đối với sự sống sót của tế bào) được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2D phiên bản số 4 và Excell để tính giá trị Standard Deviation. Độ chính xác của số liệu được tính bằng R2.
2.4.7. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm [52, 77]
- Nguyên tắc: Hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ (Multimicrodilution assay).Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử bằng cách đo độđục (turbidity) của môi trường nuôi cấy tế bào vi sinh vật, thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ nhỏ nhất của chất thửức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật), IC50
(nồng độ chất thửức chế 50% sự phát triển của vi sinh vật), MBC (nồng độ nhỏ nhất của chất thử diệt vi sinh vật). Trong đó, giá trị MIC được đọc bằng mắt thường và giá trị IC50được tính theo công thức:
OD(chất thử) - OD( H2O2 ) OD(tế bào) - OD(H2O2 )
% sống sót = x 100
OD(mẫu thử) - OD(control -) OD(control +) - OD(control -)
43
Trong đó, control (-): môi trường nuôi cấy, control (+): môi trường chứa vi sinh vật. - Pha loãng mẫu thử: mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất vô trùng thành một dãy nồng độ từ cao xuống thấp. Nồng độ chất thử lần lượt là 128 μg/ml, 32 μg/ml, 8 μg/ml, 2 μg/ml và 0,5 μg/ml.
- Thử hoạt tính: Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn và nấm với nồng độ 5x105 CFU/ml khi tiến hành thử. Lấy 10 μl dung dịch mẫu thử theo các nồng độđã được pha loãng, thêm 200 μl dung dịch vi khuẩn và nấm, ủở 370C. Sau 24 giờ, đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại các giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50được tính toán dựa trên số liệu đo độđục tế bào bằng máy quang phổở bước sóng 595 nm và phần mềm raw data.
- Chất kháng sinh tham khảo:
Kháng sinh Ampicillin cho các chủng vi khuẩn gram dương và chủng Escherichia coli
với giá trị IC50 trong khoảng 0,05 – 22 μg/ml.
Kháng sinh Streptomycin cho các chủng vi khuẩn gram âm Salmonella enteric và
Pseudomonas aeruginosa với giá trị IC50 trong khoảng 10 – 15 μg/ml.
Kháng sinh Amphotericin B cho nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0,5 – 1 μg/ml.
2.4.8. Phương pháp thử hoạt tính kích thích miễn dịch[26, 29, 31, 67, 84]
2.4.8.1. Phương pháp tách tế bào lympho
- Động vật thí nghiệm: Thỏ 3 tháng tuổi khỏe mạnh, được nuôi tại chuồng nuôi của viện Công nghệ sinh học. Thỏđược cho ăn thức ăn tiêu chuẩn và nước uống tự do.
- Lấy 5ml máu từ tĩnh mạch thỏ khỏe mạnh, được chống đông bằng heparin phủ lên thể tích ficoll paque tương đương, sau đó ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 30 phút. Tách, thu lấy lớp giữa, loại bỏ hồng cầu còn lại bằng NH4Cl 8,5%. Sau khi ly tâm, cặn tế bào được hòa lại trong HBSS có CaCl2 và MgSO4. Số tế bào được đếm bằng buồng đếm neubaur. Tế bào lympho sau khi tách được hòa trong môi trường RPMI có bổ sung 10% fetal bovine serum - FBS (GIBCO) với nồng độ tế bào 2x106 tế bào/ml.
2.4.8.2. Phép thử sàng lọc khả năng kích thích miễn dịch
Hoạt tính kích thích miễn dịch của các mẫu được xác định theo phương pháp MTT (Mosmann (1983)). Phép thửđược thực hiện như sau:
- Tế bào lympho (180µl) được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng với nồng độ 2x106 tế bào/ml.
44
- Chất thử (20 µl) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ là 100 µg/ml; 20 µg/ml; 4µg/ml; 0,8 µg/ml. Concavalin A được sử dụng làm đối chứng với nồng độ là 5 µg/ml, 2,5µg/ml, 1,25µg/ml và 0,625µg/ml. Mẫu được ủ trong thời gian 48h ở 37 oC, 5% CO2.
Ba giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào (180µl) sẽđược sử dụng làm đối chứng âm.
- Sau giai đoạn phát triển trong tủấm CO2, thêm vào mỗi giếng 50µl MTT 1mg/ml. Sau khi ủ đĩa tế bào ở 37o C trong 4h, loại bỏ môi trường và thêm vào mỗi giếng 100 µl DMSO 10%. Đĩa tế bào được đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) đểđọc kết quả về hàm lượng màu qua phổ hấp phụở bước sóng 490nm. Chỉ số kích thích (SI – stimulate index) được tính theo công thức:
SI = OD (chất thử) / OD (đối chứng âm)
- Các phép thửđược lặp lại 3 lần đểđảm bảo tính chính xác.
- DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Chất thử nào có SI > 1,2 sẽ được xem là có khả năng kích thích miễn dịch. Nồng độ kích thích 50% sự phát triển của tế bào (SD50 - stimulate dose at 50%) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve.
45
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập một số hợp chất có trong lá đu đủ3.1.1. Chiết phân đoạn cặn chiết trong lá đu đủ 3.1.1. Chiết phân đoạn cặn chiết trong lá đu đủ
Trong cặn chiết (chiết bằng MeOH 100%) chứa các loại hợp chất hữu cơ có trong lá đu đủ từ không phân cực đến rất phân cực. Vì thế rất khó để tách riêng từng hợp chất tinh khiết cho các khảo sát tiếp theo. Do đó, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng để phân chia cặn chiết thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau. Với mục đích thu các phân đoạn cặn chiết để sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư nên chỉ cần làm thí nghiệm với lượng nguyên liệu nhỏ. Chúng tôi chọn kỹ thuật chiết siêu âm nhằm rút ngắn thời gian và giảm lượng dung môi sử dụng.
Thí nghiệm được tiến hành như sau: Lấy 200 gam bột lá đu đủ, sử dụng dung môi MeOH 100%, siêu âm 30 phút ở nhiệt độ thường, tỷ lệ bột lá đu đủ/MeOH = 1/3. Gộp dịch chiết MeOH, lọc, cô cạn dung môi dưới áp suất giảm, loại bỏ hoàn toàn dung môi thu được 13,1 gam cặn chiết. Cặn chiết được hòa tan bằng 100 ml nước cất. Sau đó chiết phân bố lần lượt bằng các dung môi: n-hexan, CH2Cl2, EtOAc, BuOH. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm, hút chân không để làm khô hoàn toàn dung môi thu được các cặn chiết như sau:
Bảng 3.1: Kết quả chiết phân đoạn cặn chiết trong lá đu đủ
Tên phân đoạn Cặn n-hexan Cặn CH2Cl2 Cặn EtOAc Cặn BuOH Cặn nước còn lại Khối lượng cặn chiết (gam) 3,524 0,932 0,422 2,174 5,617 Hàm lượng (% so với khối lượng lá khô) 1,76 0,47 0,21 1,09 2,81 Qua kết quảở bảng 3.1 cho thấy:
Phân đoạn n-hexan có hàm lượng cặn chiết là 1,76% so với khối lượng lá khô, trong phân đoạn này chủ yếu là các hợp chất không phân cực hoặc tính phân cực rất kém. Có thể có các hydrocacbon béo và thơm (như tryglycerid, este béo, axit béo,…), các sterol, carotenoid,..
46
lớn. β-carotene, luteine chiếm tỷ lệ tương ứng là 57,05 và 11,864% so với tổng các chất carotenoid [11].
Phân đoạn CH2Cl2 có hàm lượng cặn chiết là 0,47% so với khối lượng lá khô, trong phân đoạn này chủ yếu là các hợp chất ít phân cực. Phân đoạn EtOAc có hàm lượng cặn chiết là 0,21% so với khối lượng lá khô, trong phân đoạn này chủ yếu là các hợp chất phân cực trung bình. Trong hai phân đoạn này có thể có các sesquiterpen, diterpene, quinon, các aglycon do hợp chất glycosis bị thủy phân, một số alkaloid loại bazơ yếu.
Theo tài liệu đã công bố, alkaloid có trong lá đu đủ thuộc loại bazơ yếu [8, 39, 87].
Sơđồ 3.1: Sơđồ phân đoạn các cặn chiết từ lá đu đủ
Bột lá đu đủ
- Chiết bằng MeOH, siêu âm 30 phút x 3 lần, nhiệt độ thường, bột lá/MeOH =1/3
- Cất loại dung môi dưới áp suất giảm Cặn chiếtMeOH - Thêm nước cất (100 ml) - Chiết với n-hexan, 3 lần x 100ml Cặn chiết n-hexan Cặn chiết CH2Cl2 Cặn chiết EtOAc Cặn chiết BuOH Cặn nước cònlại Pha n-hexan Pha nước còn lại
Chiết với CH2Cl2 3 lần x 100 ml Pha nước còn lại Chiết với EtOAc 3 lần x 100 ml Pha CH2Cl2
Pha EtOAc Pha nước còn lại
Chiết với BuOH 3 lần x 100 ml
47
Phân đoạn BuOH có hàm lượng cặn chiết là 1,09% so với khối lượng lá khô, trong phân đoạn này chủ yếu là các hợp chất phân cực mạnh. Cặn nước còn lại có hàm lượng cặn chiết là 2,81% so với khối lượng lá khô, trong phân đoạn này chủ yếu là các hợp chất phân cực rất mạnh. Trong hai phân đoạn này có thể có các chất màu thực vật, các glycosis (saponin,…), các alkaloid ở dạng muối, các muối amin, các tannin, hydratcacbon có khối lượng phân tử nhỏ như monosacarid, oligosacarid, một số polysacarid như pectin, chất nhầy, chất gôm,.. Các muối vô cơ NaCl, KCl, CaCl2,…
3.1.2. Chiết tách thu cặn chiết ở phân đoạn CH2Cl2
Sau khi sàng lọc biết phân đoạn CH2Cl2 có hoạt tính gây độc tế bào ung thư. Chúng tôi tiến hành chiết thu cặn CH2Cl2 phục vụ cho việc phân lập các chất. Để có đủ lượng cặn chiết cho quá trình phân lập, cần phải chiết một lượng nguyên liệu lớn (20 kg). Do vậy, chúng tôi chọn phương pháp chiết ngâm để thực hiện quá trình này. Quá trình chiết như sau:
Sơđồ 3.2: Sơđồ chiết thu cặn CH2Cl2 từ lá đu đủ
Bột lá đu đủ khô 20 kg
- Ngâm chiết với MeOH 100% (3 lần x 24 giờ) ở nhiệt độ thường, bột lá/MeOH =1/5
- Cất loại dung môi dưới áp suất giảm 3 lít dịch chiết MeOH
- Hòa vào nước cất (5 lít)
- Chiết với n-hexan (3 lần x 5 lít) Cặn n-hexan 1009,20 g Cặn CH2Cl2 101,90 g Pha nước còn lại Chiết với CH2Cl2 (6 lần x 5 lít) Pha nước còn lại Pha CH2Cl2 Pha n-hexan Cất loại dung môi dưới áp suất giảm Cất loại dung môi dưới áp suất giảm
48
Lấy 20 kg bột lá đu đủ khô ngâm chiết với MeOH 100%, tỷ lệ lá đu đủ/ dung môi = 1/5, ngâm chiết ở nhiệt độ thường x 3 lần x 24 giờ. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho đến khi còn 3 lít dịch chiết đặc, rồi thêm 5 lít nước và chiết lần lượt với n-hexan (3 lần x 5 lít), CH2Cl2 (6 lần x 5 lít). Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 1009,20 gam cặn chiết n-hexan, 101,90 gam cặn chiết CH2Cl2 .
3.1.3. Phân lập cặn chiết phân đoạn CH2Cl2
Sau quá trình ngâm chiết thu được cặn CH2Cl2. Chúng tôi tiến hành phân tách cặn CH2Cl2 thành các phân đoạn khác nhau, giúp cho quá trình phân lập thuận lợi và nhanh gọn hơn.
Từ 101,90 gam cặn chiết CH2Cl2, tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH gradient (bắt đầu từ 0% MeOH đến 50% MeOH). Cuối cùng dùng dung môi MeOH 100% để rửa toàn bộ các chất còn bị giữ lại trên cột sắc ký.
Sử dụng sắc ký lớp mỏng để kiểm tra các phân đoạn, soi UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm, hiện màu bản mỏng bằng thuốc thử Ce(SO4)2 và vanilin.
Các phân đoạn được loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm, hút chân không để làm khô hoàn toàn dung môi. Kết quả, thu được 13 phân đoạn chính như sau:
Bảng 3.2: Khối lượng các phân đoạn từ cặn chiết CH2Cl2 của lá đu đủ
STT Kí hiệu phân đoạn Khối lượng (g)
1 F1 1,0530 2 F2 2,4254 3 F3 2,3174 4 F4 3,6284 5 F5 2,2090 6 F6 3,0837 7 F7 1,2896 8 F8 5,2600 9 F9 13,8602 10 F10 10,0700 11 F11 20,5137 12 F12 4,2901 13 F13 27,6800
49
Kết quả trên cho thấy, trong cặn chiết CH2Cl2 có nhiều thành phần khác nhau, với khối lượng khác nhau. Có những phân đoạn ở dạng rắn khô, có những phân đoạn ở dạng dầu. Màu sắc của các phân đoạn cũng khác nhau, có một số phân đoạn có màu đen, nâu đen, có một số phân đoạn có màu vàng đỏ.
Tổng khối lượng của 13 phân đoạn thu được là 97,6765 gam, tỷ lệ thu hồi đạt 97,678%. Do một số chất màu còn bị silica gel giữ lại trên cột sắc ký nên tỷ lệ thu hồi các chất luôn nhỏ hơn 100%.
3.1.4. Phân lập các hợp chất từ một số phân đoạn của cặn chiết CH2Cl2
Sau khi tiến hành sắc kí cột silica gel phần cặn chiết CH2Cl2 với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH gradient thu được 13 phân đoạn chính kí hiệu F1- F13. Định tính alkaloid bằng sắc kí bản mỏng 13 phân đoạn, sử dụng thuốc thử dragendoff cho thấy phân đoạn F9, F10 và F11 có alkaloid. Lấy 3 phân đoạn có alkaloid (F9, F10, F11) axit hóa bằng HCl 1N đến pH = 4 rồi chiết bằng EtOAc, dịch chiết EtOAc được loại dung môi dưới áp suất giảm thu được phân đoạn không chứa alkaloid ký hiệu là F9.I, F10.I, F11.I. Pha nước được kiềm hóa bằng NaHCO3đến pH = 8, rồi chiết bằng CH2Cl2. Gộp dịch chiết CH2Cl2 rồi cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các phân đoạn chứa alkaloid ký hiệu là F9.II, F10.II, F11.II.
Từ phân đoạn F5, sau khi tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH gradient, thu được 6 phân đoạn nhỏ kí hiệu F5.1-F5.6 Phân đoạn F5.2 được tinh chế bằng cột sephadex với dung môi MeOH thu được chất sạch CP1 (139,6 mg).
Từ phân đoạn F8, sau khi tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi n- hexan/EtOAc gradient thu được 5 phân đoạn nhỏ kí hiệu F8.1-F8.5 Phân đoạn F8.3 được tinh chế bằng cột sephadex với dung môi MeOH và cột silica gel hệ dung môi n- hexan/EtOAc xuất hiện tinh thể. Lọc rửa bằng n-hexan/CH2Cl2 thu được chất sạch CP2
(6,7 mg).
Từ phân đoạn F9.I, sau khi chạy cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc gradient và HCOOH (1%) thu được 11 phân đoạn nhỏ kí hiệu F9.I.1-F9.I.11 Phân đoạn F9.I.3 được tinh chế bằng cột sephadex với dung môi ethanol và cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc gradient thu được chất sạch CP3 (6 mg). Phân đoạn F9.I.11 được tinh chế bằng cột sephadex với dung môi MeOH và cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/axeton geadient thu được chất sạch CP4 (16,4 mg).
50
Từ phân đoạn F11.II, sau khi chạy cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc/NH4OH và CH2Cl2/MeOH/NH4OH thu được 7 phân đoạn nhỏ kí hiệu F11.II.1- F11.II.7. Kết tinh phân đoạn F11.II.4 bằng hệ dung môi n-hexan/CH2Cl2 thu được chất sạch CP5 (210,1 mg). Dịch cái tiếp tục được tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc/NH4OH và sắc ký cột sephadex với dung môi MeOH thu được chất sạch CP6 (18,7 mg).
51 Sơđồ 3.3: Phân lập các hợp chất từ cặn chiết CH2Cl2 của lá đu đủ Kí hiệu: M: Methanol D: Diclorometane E: Ethyl acetate H: n-Hexan E0: Ethanol A: Acetone CC: sắc ký cột Cặn CH2Cl2 101,90 gam CC, D/M (0-50% M)