Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp hoặc dạng hỗn dịch trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS. Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủấm CO2ởđiều kiện 370C, 5% CO2.
2.4.2. Phương pháp thửđộđộc tế bào (cytotoxic assay) [26, 65, 84, 86]
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thửđộđộc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc,
37
phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thưởđiều kiện
in vitro. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thửđược thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
- Chất thử (10 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ 100 g/ml; 20g/ml; 4 g/ml; 0,8 g/ml.
- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 l môi trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày.
- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180l) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽđược cố định tế bào bằng axit trichloracetic – TCA.
- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cốđịnh vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờở 37 0C. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% axit acetic rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.
- Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽđược xác định thông qua công thức sau:
- Các phép thửđược lặp lại 3 lần đểđảm bảo tính chính xác. Ellipticine luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml.
[OD(chất thử) - OD(ngày 0)] OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0) % sống sót =
% ức chế = 100% - % sống sót
38
- DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽđược xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. Chất thử nào có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50 4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽđược xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư.
2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme caspase 3/7 [37, 41, 100]
Được thực hiện dựa trên bộ kit Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay (Promega) theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.
Cho 50 µl hỗn dịch tế bào LU–1 ra đĩa 96 giếng với nồng độ tế bào thích hợp. Nồng độ tế bào được khuyến cáo sử dụng là 2x105 tế bào/ml.
Tiếp theo bổ sung 50 µl mẫu thửở các nồng độ vào các giếng thí nghiệm, chất đối chứng dương được sử dụng là Tamoxifen, đối chứng âm được bổ sung bằng 50 µl dung môi pha mẫu. Ủ mẫu 5h ở 370C, 5% CO2.
Thêm 100µlApo-ONE® Caspase-3/7 Reagent cho tất cả các giếng thí nghiệm. Để đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian từ 1- 18 h. Đọc kết quả trên máy Tecan GENios Pro microplate reader, đo cường độ huỳnh quang(fluorescence – RFU)ở bước sóng: 485 ± 20 nm (excitation wavelength range) và 530 ± 25 nm (emission wavelength). Khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của mẫu được đánh giá thông qua công thức:
Hoạt tính caspase = Giá trị RFU của mẫu thử - Giá trị RFU của đối chứng âm
Song song với việc xác định khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của mẫu thí nghiệm, phương pháp nhuộm Sulforhodamine B cũng được tiến hành để xác định tính độc tế bào của mẫu ở cùng nồng độ trên thí nghiệm caspase, với cùng thời gian ủ mẫu và các điều kiện thí nghiệm khác.
- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp tương đương với nồng độ tế bào trong thí nghiệm caspase (trong 50 l môi trường).
- Tiếp theo cho 50 µl mẫu thử ở các nồng độ vào các giếng thí nghiệm, chất đối chứng dương được sử dụng là tamoxifen, đối chứng âm được bổ sung bằng 50 µl dung môi pha mẫu. Ủ mẫu 5h ở 370C, 5% CO2.
39
- Cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37 0C. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% axit axetic rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.
- Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụở bước sóng 515 nm. Tỉ lệ sống sót của tế bào khi có mặt chất thử so với giếng đối chứng âm (không được ủ mẫu mà được thay thế bằng dung môi pha mẫu DMSO 10%) sẽđược xác định thông qua công thức sau:
2.4.4. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng cách loại bỏ gốc tự do DPPH [32] tự do DPPH [32]
Nguyên tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu DPPH của chất thử, được xác định bằng phép đo độ hấp thụở bước sóng 517 nm trên máy quang phổ.
Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất chống oxy hóa được minh họa bằng phản ứng sau: N N. N O2 N O2 O2N N N H N O2 N O2 O2N DPPH DPPHH
Hình 2.1. Sơđồ biểu diễn phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất chống oxy hóa
Cách tiến hành: Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1 mM trong MeOH. Chất thử được pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt được một dãy các nồng độ 128 μg/ml, 32 μg/ml, 8 μg/ml, 2 μg/ml và 0,5 μg/ml.
OD(chất thử) OD( DMSO )
% sống sót = x 100
40
Để thời gian phản ứng 30 phút ở 370C, đọc độ hấp thụ của DPPH chưa phản ứng bằng máy đo quang phổở bước sóng 517 nm. % quét gốc tự do DPPH của mẫu thửđược tính theo công thức sau:
EC50 (Nồng độ có hiệu quả 50%) được tính theo đồ thị tương quan giữa giá trị SC với các nồng độ khác nhau của chất thử tính bằng phần mềm Excell.
Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ DPPH:
Hình 2.2: Tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ DPPH
2.4.5. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng thửnghiệm malonyl dialdehyd (MDA test) [20, 53, 90] nghiệm malonyl dialdehyd (MDA test) [20, 53, 90]
Nguyên tắc: Xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid thông qua việc xác định hàm lượng MDA theo phương pháp của Stroev E A, Makarova V G (1989), Viện Dược liệu - Bộ Y Tế (2006). MDA là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào. Khi cho phản ứng với axit thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử axit thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm. Phản ứng thực hiện ở môi trường pH 2 - 3, ở nhiệt độ 90 - 100 0C trong vòng 10 - 15 phút. Đo cường độ màu của phức suy ra lượng MDA có trong mẫu. Phương trình phản ứng như sau:
OD(mẫu trắng) - OD(mẫu thử) OD(mẫu trắng)
41 C H CH2 O C H O HN N O S O H HN N O S O H CH CH HC N N H S O O 2 - 2 H2 to +
Malonyl dialdehyt Axit thiobarbituric Phức trimethin
Hình 2.3:Phản ứng tạo phức màu giữa MDA và axit thiobarbituric
Cách tiến hành:
- Pha thuốc thử TBA 0,8 %
- Mỗi mẫu được tiến hành nghiên cứu ở 4 nồng độ: 100 μg/ml, 50 μg/ml, 25 μg/ml, 12,5 μg/ml.
- Tách não chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm phosphat 5 mM theo tỉ lệ 1: 10 (não: dung dịch đệm) ở nhiệt độ 0 - 5 0C. Lấy 0,5 ml dịch đồng thể, thêm vào 0,1 ml các nồng độ mẫu thử và 1,4 ml đệm phosphat, ủở 37 0C trong 15 phút. Kết thúc phản ứng bằng 1 ml axit tricloacetic 10%, ly tâm 10000 vòng/phút. Lấy 2 ml dịch trong cho phản ứng với 1 ml axit thiobarbituric 0,8%, ủở 1000C trong 15 phút và đo màu ở bước sóng 532 nm.
- Trolox là đồng phân của vitamin E được sử dụng làm chất đối chứng.
Tính kết quả: Hoạt tính chống oxy hóa HTCO (%) được tính theo công thức:
OD đối chứng: mật độ quang của dung môi DMSO OD chất thử: mật độ quang của mẫu thử
Cách tính giá trị ED50: Giá trị ED50 được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2D phiên bản số 4 và Excell để tính giá trị Standard Deviation. Độ chính xác của số liệu được tính bằng R2
2.4.6. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá in vitro trên tế bào gan chuột [5, 20, 62] chuột [5, 20, 62]
2.4.6.1. Phương pháp phân lập và nhân nuôi trực tiếp tế bào gan chuột
Chuột BALB/c khoẻ mạnh được sử dụng để tách tế bào tế bào gan. Khử trùng và giết chết chuột bằng cồn 70oC, tách lấy gan. Rửa gan bằng dung dịch PBS có 10% kháng sinh. Dùng panh, kéo, kim tiêm gạt, tách tế bào gan trong PBS. Thu dịch có tế bào gan, li
OD(đối chứng) - OD(chất thử) OD(đối chứng)
42
tâm, loại bỏ dịch nổi. Hoà cặn tế bào trong NH4Cl, li tâm thu cặn tế bào, cho môi trường MEME có 10% FBS và các thành phần cần thiết khác. Nuôi trong tủấm ở 37oC, 5%CO2.
2.4.6.2. Phép thử sinh học kiểm tra khả năng chống oxy hoá của hoạt chất trên tế
bào gan
- Tế bào gan sau phân lập được nuôi ổn định 1-2 ngày, sau đó đưa vào đĩa 96 giếng với mật độ 1 x 104 tế bào/giếng, nuôi qua đêm trong tủấm 5% CO2, ở 37oC.
- Thêm hoạt chất nghiên cứu hoặc cucurmin (đối chứng dương) ở các nồng độ khác nhau, ủ trong 2 giờ.
- Thêm 100 µM H2O2 vào mỗi giếng, ủ trong 2 giờ. - Cho 50 µl/giếng MTT nồng độ 1mg/ml, ủ trong 4 giờ. - Loại bỏ dịch nổi, thêm vào mỗi giếng 100 µl DMSO 100%. - Đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 492 nm.
- Tính kết quả:
Giá trị ED50 (nồng độ bảo vệđược 50% đối với sự sống sót của tế bào) được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2D phiên bản số 4 và Excell để tính giá trị Standard Deviation. Độ chính xác của số liệu được tính bằng R2.
2.4.7. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm [52, 77]
- Nguyên tắc: Hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ (Multimicrodilution assay).Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử bằng cách đo độđục (turbidity) của môi trường nuôi cấy tế bào vi sinh vật, thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ nhỏ nhất của chất thửức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật), IC50
(nồng độ chất thửức chế 50% sự phát triển của vi sinh vật), MBC (nồng độ nhỏ nhất của chất thử diệt vi sinh vật). Trong đó, giá trị MIC được đọc bằng mắt thường và giá trị IC50được tính theo công thức:
OD(chất thử) - OD( H2O2 ) OD(tế bào) - OD(H2O2 )
% sống sót = x 100
OD(mẫu thử) - OD(control -) OD(control +) - OD(control -)
43
Trong đó, control (-): môi trường nuôi cấy, control (+): môi trường chứa vi sinh vật. - Pha loãng mẫu thử: mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất vô trùng thành một dãy nồng độ từ cao xuống thấp. Nồng độ chất thử lần lượt là 128 μg/ml, 32 μg/ml, 8 μg/ml, 2 μg/ml và 0,5 μg/ml.
- Thử hoạt tính: Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn và nấm với nồng độ 5x105 CFU/ml khi tiến hành thử. Lấy 10 μl dung dịch mẫu thử theo các nồng độđã được pha loãng, thêm 200 μl dung dịch vi khuẩn và nấm, ủở 370C. Sau 24 giờ, đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại các giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50được tính toán dựa trên số liệu đo độđục tế bào bằng máy quang phổở bước sóng 595 nm và phần mềm raw data.
- Chất kháng sinh tham khảo:
Kháng sinh Ampicillin cho các chủng vi khuẩn gram dương và chủng Escherichia coli
với giá trị IC50 trong khoảng 0,05 – 22 μg/ml.
Kháng sinh Streptomycin cho các chủng vi khuẩn gram âm Salmonella enteric và
Pseudomonas aeruginosa với giá trị IC50 trong khoảng 10 – 15 μg/ml.
Kháng sinh Amphotericin B cho nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0,5 – 1 μg/ml.
2.4.8. Phương pháp thử hoạt tính kích thích miễn dịch[26, 29, 31, 67, 84]
2.4.8.1. Phương pháp tách tế bào lympho
- Động vật thí nghiệm: Thỏ 3 tháng tuổi khỏe mạnh, được nuôi tại chuồng nuôi của viện Công nghệ sinh học. Thỏđược cho ăn thức ăn tiêu chuẩn và nước uống tự do.
- Lấy 5ml máu từ tĩnh mạch thỏ khỏe mạnh, được chống đông bằng heparin phủ lên thể tích ficoll paque tương đương, sau đó ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 30 phút. Tách, thu lấy lớp giữa, loại bỏ hồng cầu còn lại bằng NH4Cl 8,5%. Sau khi ly tâm, cặn tế bào được hòa lại trong HBSS có CaCl2 và MgSO4. Số tế bào được đếm bằng buồng đếm neubaur. Tế bào lympho sau khi tách được hòa trong môi trường RPMI có bổ sung 10% fetal bovine serum - FBS (GIBCO) với nồng độ tế bào 2x106 tế bào/ml.
2.4.8.2. Phép thử sàng lọc khả năng kích thích miễn dịch
Hoạt tính kích thích miễn dịch của các mẫu được xác định theo phương pháp MTT (Mosmann (1983)). Phép thửđược thực hiện như sau:
- Tế bào lympho (180µl) được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng với nồng độ 2x106 tế bào/ml.
44
- Chất thử (20 µl) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ là 100 µg/ml; 20 µg/ml; 4µg/ml; 0,8 µg/ml. Concavalin A được sử dụng làm đối chứng với nồng độ là 5 µg/ml, 2,5µg/ml, 1,25µg/ml và 0,625µg/ml. Mẫu được ủ trong thời gian 48h ở 37 oC, 5% CO2.
Ba giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào (180µl) sẽđược sử dụng làm đối chứng âm.
- Sau giai đoạn phát triển trong tủấm CO2, thêm vào mỗi giếng 50µl MTT 1mg/ml. Sau khi ủ đĩa tế bào ở 37o C trong 4h, loại bỏ môi trường và thêm vào mỗi giếng 100 µl DMSO 10%. Đĩa tế bào được đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) đểđọc kết quả về hàm lượng màu qua phổ hấp phụở bước sóng 490nm. Chỉ số kích thích (SI – stimulate index) được tính theo công thức:
SI = OD (chất thử) / OD (đối chứng âm)
- Các phép thửđược lặp lại 3 lần đểđảm bảo tính chính xác.
- DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Chất thử nào có SI > 1,2 sẽ được xem là có khả năng kích thích miễn dịch. Nồng độ kích thích 50% sự phát triển của tế bào (SD50 - stimulate dose at 50%) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve.
45
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN