3.2.2.1. Lấy mẫu phân
Nguồn mẫu phân được thu từ gà nhiễm Eimeria (dựa vào triệu chứng lâm sàng). Phân được cho vào túi nilon và bảo quản ở tủ lạnh -20ºC. Các mẫu được thu nhận từ nhiều vùng địa phương khác nhau và đã được thẩm định loài sơ bộ bằng hình thái học.
3.2.2.2. Phương pháp thu oocyst cầu trùng
Oocyst phân lập từ mẫu phân bằng phương pháp phù nổi trong dung dịch nước muối bão hòa của Shirley,1995.
Tiến hành:
Mẫu phân được cho vào ống fancol 50 mL, khuấy tan hoàn toàn với nước muối bão hòa, sau đó để yên khoảng để khoảng 15 – 30 phút. Dùng pipette hút khoảng 5 mL lớp mặt phía trên chia đều vào 2 ống fancol 15ml (mỗi ống 2,5mL),
cho thêm mỗi ống 12,5mL nước cất và ly tâm 14000 vòng/phút trong 5 phút, thu kết tủa. Kết tủa được rửa lại nhiều lần với nước cất vô trùng và bảo quản – 20ºC.
3.2.2.3. Phương pháp tách ADN tổng số.
ADN được tách từ Oocysts cầu trùng được tách chiết theo phương pháp của Lien và cộng sự (2007) có sửa đổi [35].
Tiến hành:
Bước 1. Oocyst cầu trùng từ phân được thu nhận bằng phương pháp phù nổi và rửa nhiều lần với nước cất vô trùng bằng cách ly tâm 14000 vòng trong 5 phút, thu kết tủa. Bổ sung 1mL dung dịch NaClO 5.75 % vào kết tủa, vortex cho đồng nhất, ủ trên đá lạnh 30 phút sau đó rửa 2 – 3 lần với nước cất (1mL/lần) bằng cách ly tâm 12000 vòng trong 5 phút.
Bước 2. Bổ sung một khối lượng tương đương hạt thủy tinh (đường kính 0,1 mm) vào kết tủa, vortex mạnh trong 2 phút. Tái huyền phù với 350 μL lysis 1 (600 mM EDTA, 1.3% N – lauroylsarcosine, 2 mg/mL proteinase K, pH 9.5), vortex cho đồng nhất và ủ 65ºC trong 45 phút. Sau đó bổ sung 350 μL cetyl – trimethyl ammonium bromide (CTAB) buffer [2% (w/v) CTAB, 1.4 M NaCl, 0.2% β – mercaptoethanol, 20 mM EDTA, 100 mM Tris – Cl, pH 8.0], vortex và tiếp tục ủ ở 60ºC trong 1giờ. Ly tâm 15000 vòng/phút trong 10 phút thu dịch nổi chuyển qua ống eppendorf mới.
Bước 3. Bổ sung một thể tích tương đương của phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) vào dịch nổi trên, vortex, ly tâm 15000 vòng trong 15 phút, thu dịch nổi chuyển qua một eppendorf mới. Tiến hành như trên với một thể tích tương đương của chloroform, vortex, ly tâm 15000 vòng trong 15 phút, thu dịch nổi.
Bước 4. Bổ sung 2 thể tích của ethanol 100% lạnh vào dịch nổi, ủ ở – 20ºC trong 30 phút, ly tâm 15.000 vòng trong 15 phút thu kết tủa.
Bước 5. Kết tủa ADN được rửa với 70% ethanol lạnh, ly tâm 12000 vòng 5 phút (lặp lại 3 lần).
Bước 6. Kết tủa được hòa tan trở lại với 50 µL TE (50 mM Tris – HCl, 10 mM EDTA), pH 7.2) hoặc nước cất vô trùng, ADN được bảo quản – 20ºC trước khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2.4. Phản ứng PCR
Sau khi tách chiết ADN tổng số theo phương pháp của Lien và cộng sự (2007) từ Eimeria được thu nhận từ phân và ruột gà, chúng tôi tiến hành phân
lập các gen với các cặp mồi đặc hiệu dựa trên kỹ thuật PCR, các cặp mồi sử dụng để phân lập được trình bày trong các bảng 1.
Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 200 ng ADN, 25 µl 2× PCR master mix (2,4 mM dNTP mỗi loại, 0,3 đơn vị Taq ADN polymerase (Fermentas, Canada)), 10 pmol mồi xuôi, 10 pmol mồi ngược và bổ sung nước cất vô trùng để đạt thể tích phản ứng là 50 µl.
Phản ứng PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt (iCycler, Bio– Rad) theo quy trình sau: biến tính genome 95oC/5 phút; tiếp đến là 35 chu kỳ: 95oC/1 phút, AoC/1 phút, và 72oC/1 phút; cuối cùng là 72oC/10 phút (A là nhiệt độ bắt mồi ứng với từng loài Eimeria khác nhau với các cặp mồi khác nhau). Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên agarose gel 1% với thuốc nhuộm ethydium bromide (EtBr) (0,5 µg/mL) và phân tích hình ảnh điện di bằng hệ thống Gel Documentation (Bio – Rad).
Bảng 3.1. Một số cặp mồi đặc hiệu cho một số loài cầu trùng [21]
stt Loài Trình tự Kích thước (bp) 1 E. acervulina F – AGTCAGCCACACAATAATGGCAAACATG R – AGTCAGCCACAGCGAAAGACGTATGTG 811 2 E. tenella F – CCGCCCAAACCAGGTGTCACGR – CCGCCCAAACATGCAAGATGGC 539 3 E. mitis F – AGTCAGCCACCAGTAGAGCCAATATTTR – AGTCAGCCACAAACAAATTCAAACTCTAC 460 4 E. praecox F – AGTCAGCCACCACCAAATAGAACCTTGGR – GCCTGCTTACTACAAACTTGCAAGCCCT 354 5 E. maxima F – GGGTAACGCCAACTGCCGGGTATGR – AGCAAACCGTAAAGGCCGAAGTCCTAGA 272 6 E. necatrix F – TTCATTTCGCTTAACAATATTTGGCCTCAR – ACAACGCCTCATAACCCCAAGAAATTTTG 200
3.2.2.5. Phương pháp kiểm tra sản phẩm PCR
Sản phẩm được bảo quản ở 4ºC cho đến khi sử dụng. Điện di Šmmmm®agarose 1% để kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR với thuốc nhuộm ethydium bromide (EtBr) (0,5 µg/mL) và phân tích hình ảnh điện di bằng hệ thống Gel Documentation (Bio – Rad).
Kiểm tra sản phẩm ADN tổng số trên gel agarose 1% trong điện trường hiệu điện thế 100 V, cường độ 250 mA, trong thời gian 25 – 30 phút. Do mang điện tích âm, ADN của sản phẩm PCR sẽ dịch chuyển từ cực âm đến cực dương. Chỉ thị phân tử ADN (ADN marker) được dùng là ADN 100 – 1500 bp của hãng BioBase” chia thành 11 phân đoạn gồm: 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 1500 bp với lượng sử dụng 6 µL. Nhờ chỉ thị phân tử này mà người ta có thể xác định được độ dài của đoạn ADN cần nghiên cứu.
Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1%: lấy 0,4 g thạch agarose nguyên chất cho vào cốc đong thủy tinh chịu nhiệt, đổ vào đó 40 ml đệm TAE 1 lần (TAE có thành phần: Tris, acid acetic glacial, EDTA). Cho cốc đong vào lò vi sóng (microwave) đặt nóng chảy trong 3 phút sao cho agarose tan chảy hết. Cho 4 µl Ethidium bromide vào. Gài lược có nhiều răng vào khay của hệ thống điện di, đổ thạch ngập răng lược khoảng 0,5 cm và để nguội ở nhiệt độ phòng. Khi nguội tạo thành thạch, các răng lược sẽ tạo thành các giếng để chúng ta cho mẫu vật vào điện di kiểm tra.
Bước 2: Dìm ngập khay trong hộp điện di chứa dung dịch đệm TAE 1 lần (đệm TAE cung cấp ion cho điện trường hoạt động).
Bước 3: Tra mẫu: lấy 8 µl sản phẩm mỗi loại, trộn với 2 µl chỉ thị màu (Loading dye 5X) (thường là hỗn hợp xanh Bromophenol và glycerol) với mẫu và tra riêng biệt vào từng giếng trong thạch.
Bước 4: Tra chỉ thị phân tử: trong 1 giếng riêng biệt khác cho 7 – 10 µl chỉ thị phân tử (ADN marker) thường dùng ở đây là chỉ thị ADN của hãng BioBase) tạo thành 11 phân đoạn có độ dài từ 100 – 1500 bp.
Bước 5: Nối hệ thống điện di với nguồn điện, cực âm ở phía đầu của bản thạch, cực dương ở phía cuối, ADN sẽ chuyển dịch từ cực âm đến cực dương. Chạy điện di ở hiệu thế 100 V trong 25 – 30 phút.
Bước 6: Rửa thạch bằng nước, sau đó soi qua tia cực tím nhờ máy DOLPHIN – DOC (WEALTEC, USA) và chụp ảnh giữ mẫu kiểm tra.