Húa chất dựng trong vi nhõn giống được phõn ra làm 2 nhúm lớn là: + Nhúm húa chất khử trựng
+ Nhúm húa chất để pha mụi trường vi nhõn giống
2.1. Nhúm húa chất khử trựng
* Cồn:
Cồn được dựng trong vi nhõn giống là loại cồn 75% vừa cú khả năng khuếch tỏn và thấm sõu vừa cú tỏc dụng sỏt trựng nhưng đồng thời cũng dễ tổn thương tế bào mẫu cấy nờn khụng kộo dài thời gian ở giai đoạn này.
Cũng cú thể dựng cỏch xử lý khỏc với những mẫu đặc biệt như: quả, nụ hoa, chựm hoa cú bỳp, vẩy, mụ bao bọc, chồi nỏch hoặc chồi đỉnh được bọc kỹ bằng vẩy, sỏp ... Trường hợp này sau khi sử lý bằng cồn 75% cú thể vớt ra và
búc tỏch dần trong khi cồn bay hơi trước tủ cấy. Cũng cú lỳc phải dựng cồn 90% và đốt trờn đốn cồn khi gặp mẫu quỏ khú.
* Cỏc chất khử trựng khỏc Ca(ClO)2 NaClO H2O2 AgNO3 HgCl2 Chất khỏng sinh Nước Brụm Bảng 2. Bảng thử cỏc loại húa chất khử trựng Tờn Nồng độ % Thời gian khử trựng Độ khú Hiệu quả Ca(ClO)2 9-10 5-30 Dễ Rất tốt NaClO 2 5-30 Dễ Rất tốt H2O2 10-12 5-15 Dễ nhất Tốt Nước Brụm 1-2 2-10 Dễ Rất tốt AgNO3 1 5-30 Hơi khú Tốt HgCl2 0.1-1.0 2-15 Hơi khú Rất tốt Chất khỏng sinh 4-500ppm 30-60 Vừa Rất tốt
Cần lưu ý khi sử dụng cỏc loại hoỏ chất khử trựng:
- Ca(ClO)2 và NaClO cú tỏc dụng sỏt trựng do nguyờn tử Cl tỏch ra khỏi phõn tử trở thành dạng tự do, do đú khi sử dụng nờn dựng bỡnh nắp xoỏy để lưu giữ Cl.
- Thuốc tẩy trắng - lơ hồng rất được trọng dụng với mẫu xự xỡ, dầu, nhựa, lụng bỏm.... Nú cú tỏc dụng khuếch tỏn, luồn sõu, kộo đẩy cỏc vật dớnh bỏm theo kiểu hoỏ keo.
- H2O2 sỏt trựng do sự tạo thành oxy nguyờn tử. Cũng như 2 chất trờn, cả 3 chất này dễ loại trừ tàn dư sau xử lý. Thường chỉ cần trỏng rửa nước cất vụ trựng 4-6 lần là đủ.
- HgCl2 cú hiệu lực sỏt trựng rất mạnh nhưng tàn dư cũng khú tẩy rửa. Do đú sau xử lý phải trỏng rửa nước cất vụ trựng ớt nhất 6-8 lần.
Một số năm gần đõy nhiều người thớch dựng Tween. Cỏc loại thường dựng là: Tween20, Tween40, Tween60, nhưng tốt nhất là Tween80 và
TweenX. Đõy là loại thuốc hoạt hoỏ bề mặt tiếp xỳc, do đú rất rễ luồn lỏch, loại trừ bọt khớ. Tuy nhiờn tỏc hại của nú là làm tăng tổn thương mẫu cấy, do đú phải thực hiện nghiờm ngặt thời gian và nồng độ sử dụng.
2.2. Nhúm húa chất dựng để pha mụi trường vi nhõn giống
Nhúm húa chất dựng để pha chế mụi trường dựng cho nuụi cấy mụ gồm cú cỏc thành phần sau:
- Cỏc loại muối khoỏng (Cỏc nguyờn tố đa lượng và cỏc nguyờn tố vi lượng)
- Cỏc Vitamin
- Cỏc chất điều hũa sinh trưởng - Cỏc chất hữu cơ khỏc
- Chất nền (chất đụng cứng mụi trường) - Nguồn cỏc bon
- Than hoạt tớnh (than củi)
a. Cỏc loại muối khoỏng
Muối khoỏng là thành phần khụng thể thiếu trong cỏc mụi trường nuụi cấy mụ và tế bào thực vật:
- Muối khoỏng là cỏc vật liệu (nguồn N, S, P....) cho sự tổng hợp cỏc chất hữu cơ. Nitơ, lưu huỳnh, phốt-pho là cỏc thành phần khụng thể thiếu của cỏc phõn tử protein, cỏc axớt nucleic và nhiều chất hữu cơ khỏc. Canxi và axớt boric được tỡm thấy chủ yếu ở thành tế bào, đặc biệt là canxi cú nhiệm vụ quan trọng giỳp ổn định màng sinh học.
- Cỏc ion của cỏc muối hoà tan đúng vai trũ quan trọng ổn định ỏp suất thẩm thấu của mụi trường và tế bào, duy trỡ thế điện hoỏ của thực vật.
Vớ dụ: K và C rất quan trọng trong điều hoà tớnh thấm lọc của tế bào, duy trỡ điện thế và tham gia hoạt hoỏ nhiều enzym.
Trong mụi trường, cỏc muối khoỏng được chia thành cỏc nguyờn tố vi lượng và đa lượng:
- Cỏc chất dinh dưỡng đa lượng : bao gụ̀m sỏu nguyờn tụ́ : nitrogen (N), phosphorus (P), potassium (K), calcium (Ca), magnesium (Mg) và sulphur (S) tụ̀n ta ̣i dưới da ̣ng muụ́i khoáng , là thành phần của cỏc mụi trường dinh dưỡng khỏc nhau. Tṍt cả các nguyờn tụ́ này là rṍt cõ̀n thiờ́t cho sinh trưởng của mụ và tờ́ bào thực võ ̣t.
- Cỏc nguyờn tố vi lượng : là các nguyờn tụ́ vụ cơ cõ̀n mụ ̣t lươ ̣ng nhỏ nhưng khụng thờ̉ thiờ́u cho sinh trưởng của mụ và tờ́ bào thực võ ̣t . Đó là các ion: iron (Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), boron (B), copper (Cu), và
molybdenum (Mo). Fe được cung cṍp dưới da ̣ng ch elate Fe, và Zn được dựng bỡnh thường trong cỏc mụi trường nuụi cấy . (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cỏc dạng muối tatrate và citrate Fe khú hũa tan và thường hay kết tủa trong mụi trường . Vṍn đờ̀ này có thờ̉ khắc phục bằng cách dùng
diaminetetraacetic acid (EDTA)-chelate Fe thay cho citrate Fe , đặc biờ ̣t đụ́i với quỏ trỡnh tạo phụi . Tuy nhiờn, cỏc dạng chelate EDTA khụng hoàn toàn ổn định trong mụi trường nuụi cṍy da ̣ng lỏng .
Tầm quan trọng của một số nguyờn tố vi lượng trong thành phần mụi trường cũn chưa được hiểu một cỏch rừ ràng. Co, Al, Ni... cú thể cú lợi đối với thực vật nhưng cũng cú thể là khụng cần thiết. Trong thực tế, hầu hết cỏc nguyờn tố vi lượng chỉ cú phần khoỏng của muối (cation) là quan trọng, cũn vai trũ cỏc anion cú thể là khụng cần thiết.
b. Cỏc chất Vitamin
Cỏc vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuụi cấy mụ là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol.
Thiamin là một vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả cỏc tế bào, được sử dụng với nồng độ từ 0,1-10 mg/l
Acid nicotinic và pyridoxine thường được bổ sung vào mụi trường nuụi cấy nhưng cũng khụng cấn thiết cho sự tăng trưởng của tế bào nhiều loài thực vật. Acid nicotinic thường được sử dụng với nồng độ 0,1-5 mg/l, pyridoxine được sử dụng với nồng độ 0,1-10 mg/l.
Myo-inositol thường được pha chung với dung dịch mẹ của vitamin. Mặc dự đõy là một carbohydrate chứ khụng phải là vitamin, nú cũng được chứng minh kớch thớch cho sự tăng trưởng của tế bào đa số loài thực vật. Myo- inositol thường được sử dụng trong mụi trường nuụi cấy mụ và tế bào thực vật ở nồng độ 50-5000 mg/l.
Cỏc vitamin khỏc như biotin, acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid, vitamin E (tocopherol), riboflavin và p-aminobenzoic acid cũng được sử dụng trong một số mụi trường nuụi cấy. Nhu cầu vitamin trong mụi trường nuụi cấy núi chung khụng quan trọng và chỳng cũng khụng cản trở sự tăng trưởng của tế bào. Núi chung cỏc vitamin này được thờm vào mụi trường chỉ khi nồng độ thiamin thấp hơn nhu cầu cần thiết hoặc để cho huyền phự tế bào cú thể tăng trưởng khi mật độ tế bào khởi đầu thấp.
c. Cỏc chất bổ sung vào mụi trƣờng cấy mụ
Amino acid và cỏc nguồn cung cấp nitrogen khỏc. Cỏc nguồn nitrogen hữu cơ thường sử dụng trong mụi trường nuụi cấy tế bào thực vật là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparagine và adenine. Casein hydrolysate núi chung được sử dụng với nồng độ 0,05-0,1%.
d. Cỏc chất điều hũa sinh trƣởng
Nhúm auxin
- Indole-3-acetic acid (IAA) - Indole-3-butyric acid (IBA)
- Naphtin Axetic Axit (NAA)
- 2,4-dichlorophenoxy- acetic acid (2.4D) - p-chlorophenoxy- acetic acid (CPA)
Chức năng trong hệ thống nuụi cấy mụ là
- Phõn chia tế bào - Tạo và nhõn callus
- Tạo rễ bất định (ở nồng độ cao) - Tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp) - Tạo phụi soma (2,4-D)
- Ức chế chồi nỏch
Nhúm cytokinin (hoocmon hoạt hoỏ phõn chia tế bào phõn chia tế bào và ức
chế sự già hoỏ) - Kinetin
- 6-Bezyl amino- purine (BAP) - Zeatin (Z)
- Zeatinriboside (ZR)
- Isopentenyladenosine (iPA)
Chức năng trong hệ thống nuụi cấy mụ là
- Phõn chia tế bào - Tạo và nhõn callus
- Kớch thớch bật chồi nỏch.
- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - Ức chế sự hỡnh thành rễ
- Ức chế sự kộo dài chồi. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Ức chế quỏ trỡnh già (hoỏ vàng) ở lỏ.
Nhúm gibberellin
- Gibberellic acid (GA3) - Gibberllin 1 (GA1)
- Gibberellin 4 (GA4)
Chức năng trong hệ thống nuụi cấy mụ
- Kộo dài chồi
- Phỏ ngủ ở hạt giống.
- Ức chế sự hỡnh thành rễ bất định.
- Cỏc chất ức chế tổng hợp kớch thớch quỏ trỡnh tạo củ (thõn củ, thõn hành và củ).
Nhúm cỏc chất điều hũa sinh trưởng khỏc
- Ethylene: Gõy già hoỏ lỏ, làm chớn quả
- Abscisic acid: Sự chớn của thể phụi, kớch thớch sự hỡnh thành thõn hành và thõn củ, thỳc đẩy sự phỏt triển của tỡnh trạng ngủ
- Nhúm Polyamine, Abscisic acid: Kớch thớch sự tự hỡnh thành rễ, kớch thớch sự hỡnh thành chồi, đẩy mạnh sự phỏt sinh thể phụi