Sau khi xử lý hóa chất các mẫu mica, các mẫu này sẽ được quan sát bề mă ̣t bằng hê ̣ kính hiển vi NHV-CAM (như hình 2.7). Đây là hê ̣ kính hiển vi có khả năng chu ̣p la ̣i hình ảnh quan sát được (với đô ̣ phóng đa ̣i tăng thêm 30 lần so với các loa ̣i kính hiển vi quang học thông thường) và lưu vào bô ̣ nhớ máy tính.
Hình 2.7. Hê ̣ kính hiển vi NHV-CAM
Tuy nhiên do kích thước mẫu khá nhỏ nên viê ̣c cố đi ̣nh mẫu trên kính rồi quan sát như quan sát các mô sinh ho ̣c là khá khó khăn. Bên ca ̣nh đó, ta không cần quan sát toàn bô ̣ bề mă ̣t mẫu mà chỉ quan tâm đến vùng mẫu bi ̣ phơi chiếu. Do đó, ta thiết
19
kế mô ̣t giá cho mẫu (như hình 2.8), với mu ̣c đích vừa giới ha ̣n pha ̣m vi quan sát và vừa dễ dàng di chuyển mẫu trên kính hiển vi.
Hình 2.8. Giá đặt mẫu trên kính hiển vi
Kính hiển vi có thi ̣ kính là Camera kết nối với máy tính có đô ̣ phóng đa ̣i là 30, và các vâ ̣t kính có đô ̣ phóng đa ̣i lần lượt là:
Vâ ̣t kính 4/0,10 (160/-): phóng đa ̣i ảnh lên 4 lần, pha ̣m vi bề mă ̣t mica quan sát được rô ̣ng, nhưng kích thước của vết la ̣i quá nhỏ nên ta không thể phân biê ̣t chúng với bu ̣i bẩn bám vào mẫu.
Vâ ̣t kính 10/0,25 (160/0,17): phóng đa ̣i ảnh lên 10 lần, pha ̣m vi bề mă ̣t mica quan sát được 1,0mm x 0,5 mm, các vết có thể phân biê ̣t dễ dàng với bu ̣i bẩn.
Vâ ̣t kính 40/0,65 (160/0,17): phóng đa ̣i ảnh lên 40 lần, pha ̣m vi bề mă ̣t mica quan sát được khá he ̣p, nhưng kích thước vết la ̣i to và rõ ràng.
Vâ ̣t kính 100/1,25OIL (160/0,17): chỉ dùng được khi nhỏ thêm gio ̣t dầu. Do đó, trong khóa luâ ̣n này ta cho ̣n quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở vâ ̣t kính 10/0,25 (160/0,17). Tứ c là ảnh được phóng đa ̣i lên 300 lần. Khi đó, vết quan sát được vừa đủ rõ và thi ̣ trường dưới kính hiển vi cũng không quá he ̣p.
20
Tuy nhiên, do vùng chiếu có da ̣ng tròn đường kính 6mm, nên ta sẽ chia chúng thành 28 vùng (như hình 2.9) và xem như sự phân bố vết trong mỗi vùng đó là đồng đều, để dễ dàng quan sát và ghi nhâ ̣n vết. Và do thi ̣ trường dưới kính hiển vi có diê ̣n tích nhỏ hơn kích thước mỗi vùng ta chia, nên số vết đếm được ở mỗi vùng trong 28 vùng sẽ đă ̣c trưng bởi số đếm của mỗi vùng trong ảnh mà ta ghi nhâ ̣n được.
Hình 2.9. Cách chia các vùng quan sát trên mẫu
2.3.2.Phương pháp đếm vết trên bề mă ̣t mẫu mica 2.3.2.1.Phương pháp đếm thủ công 2.3.2.1.Phương pháp đếm thủ công
Dựa vào hình ảnh các vết mà ha ̣t alpha trên mica chu ̣p được từ kính hiển vi, các vết này sẽ được ghi nhâ ̣n và thống kê tổng số đếm trên 28 vùng của mỗi mẫu.
Thực hiê ̣n đếm thủ công từng vết trên các tấm ảnh là viê ̣c làm tốn nhiều thời gian và công sức. Trung bình ta mất khoảng 3 - 5 phút để xử lý mô ̣t tấm ảnh có khoảng 200 số đếm, mỗi mẫu có 28 vùng đồng nghĩa với ta phải xử lý 28 tấm ảnh và mất khoảng 1,5 - 2 giờ để xử lý mô ̣t mẫu. Thêm vào đó, số lượng vết đếm được bằng cách thủ công còn phu ̣ thuô ̣c vào tra ̣ng thái của người đếm. Vì vâ ̣y, khóa luâ ̣n này đề xuất sử du ̣ng phần mềm Image J để đếm các vết trong các ảnh bề mă ̣t mica thu được từ kính hiển vi.
21 22 23 24 25 26 27 28 15 16 17 18 19 20 9 10 11 12 13 14 4 5 6 7 8 1 2 3
21
2.3.2.2.Phương pháp đếm vết bằng phần mềm Image J
Image J là phần mềm mã nguồn mở được phát triển bởi Viê ̣n Y tế quốc gia Hoa Kỳ (go ̣i tắt là NIH). Phần mềm này thường được dùng để phân tích băng trên gel trong sinh ho ̣c, đi ̣nh lượng các tín hiê ̣u từ kính hiển vi,… Người dùng có thể tự cải tiến các tính năng của phần mềm nếu không muốn sử du ̣ng các gói mà phần mềm hỗ trợ sẵn bằng ngôn ngữ lâ ̣p trình Java.
Ưu điểm của phần mềm:
Có thể mở rô ̣ng các tính năng bằng plug-in.
Cho phép chồng các ảnh lên nhau.
Phân tích và đếm các tế bào, đếm vết trên ảnh.
Cho phép du ̣ng hình ảnh 3D từ các ảnh 2D ban đầu.
Nhược điểm: mô ̣t trong những nhược điểm lớn nhất của Image J là các vết có đường bao bên ngoài không khép kín thì phần mềm không thể nhâ ̣n diê ̣n là mô ̣t vết.
Để đếm các vết bằng phần mềm Image J ta thực hiê ̣n các bước sau:
Bước 1: Khởi đô ̣ng phần mềm Image J (hình 2.10) và mở hình ảnh cần xử
lý.
Hình 2.10. Giao diê ̣n chính của phần mềm Image J (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 2:Khớp kích thước thâ ̣t của ảnh với kích thước của phần mềm. Cho ̣n lê ̣nh Straight rồi vẽ mô ̣t đường thằng nằm ngang (màu vàng) từ mép này đến mép kia của ảnh (như hình 2.11).
22
Hình 2.11. Thao tác với lê ̣nh Straight
Sau đó cho ̣n Analyze Set Scale cửa sổ Set Scale (như hình 2.12).
Hình 2.12. Cửa sổ Set Scale
23
Ta ̣i ô Distance in pixels chỉ đô ̣ dài tính bằng pixel của đoa ̣n thẳng mà ta vừa vẽ trên hình.
Ta ̣i ô Known distance ta nhâ ̣p kích thước thâ ̣t ảnh (ở đây là bề ngang của tấm ảnh 1mm = 1000m).
Ta ̣i ô Unit of length ta nhâ ̣p đơn vi ̣ đo chiều dài mà ta muốn (ở đây là micromet nên ta nhâ ̣p micron). Cho ̣n đơn vi ̣ chuẩn là micromet vì các ha ̣t có kích thước cỡ micromet.
Chọn Global để mă ̣c đi ̣nh tỉ lê ̣ này cho tất cả các tấm ảnh ta sẽ xử lý phía sau rồi cho ̣n OK.
Bước 3:Loa ̣i bỏ nền bằng cách cho ̣n Process Subtract Background
cửa sổ Subtract Background (như hình 2.13) sẽ xuất hiê ̣n.
Hình 2.13. Cửa sổ Subtract Background
Ta ̣i ô Rolling ball radius nhâ ̣p vào bán kính của ha ̣t tính bằng pixel (ở đây ta cho ̣n những vết có kích thước cỡ 20 pixels). Những ha ̣t nào có bán kính lớn hơn kích thước ta nhâ ̣p vào sẽ được xem như nền và sẽ bi ̣ loa ̣i bỏ.
Click Light background để hình ảnh sau khi xử lý sẽ có nền trắng. Click Separate colors tách các màu riêng biê ̣t trong hình ra để giảm nhiễu.
24
Có thể click Preview để xem trước kết quả. Cuối cùng nhấn OK.
Bước 4: Lo ̣c những ha ̣t có kích thước trong giới ha ̣n ta quan tâm.
Cho ̣n Process FFT Bandpass Filter Xuất hiê ̣n cửa sổ Bandpass Filter (như hình 2.14).
Hình 2.14. Cửa sổ FFT Bandpass Filter
Ta ̣i ô Filter large structure down to nhâ ̣p vào kích thước tối đa của ha ̣t tính bằng pixel (ở đây ta quan tâm các ha ̣t có kích thước tối đa là 15 pixels). Ta ̣i ô Filter small structure up to nhâ ̣p vào kích thước tối đa của ha ̣t tính bằng pixel (ở đây ta quan tâm các ha ̣t có kích thước tối đa là 15 pixels).
Ta ̣i ô Tolerance of direction nhâ ̣p vào sai số của kích thước ha ̣t (ở đây ta cho ̣n sai số 1%).
Sau đó nhấn OK.
Bước 5:Chỉnh cho ảnh về thang đô ̣ xám 8-bit. Cho ̣n Image Type 8-bit
25
Bước 6: Đă ̣t ngưỡng để tăng khả năng phân biê ̣t giữa vết của alpha và các vết khác. Cho ̣n Image Adjust Threshold Xuất hiê ̣n cửa sổ
Threshold (như hình 2.15). Sau đó, kéo cho ̣n ngưỡng thích hợp (ta thường sẽ cho ̣n ngưỡng mă ̣c đi ̣nh của phần mềm) rồi nhấn Apply.
Hình 2.15. Cửa sổ Threshold
Bước 7: Chuyển ảnh sang hê ̣ nhi ̣ phân, ứng với hai giá tri ̣ trắng và đen.
Cho ̣n ProcessBinary Make Binary Xuất hiê ̣n cửa sổ Make Binary (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(như hình 2.16).
26
Thresholded pixels to foreground color: quan tâm tất cả các điểm ảnh nằm trong ngưỡng đã cho ̣n ở bước trên.
Remaining pixels to foreground color: các điểm ảnh nằm ngoài ngưỡng đã cho ̣n sẽ không quan tâm tới nữa.
Black foreground, white background: phần màu đen là phần mà ta quan tâm, phần màu trắng là nền.
Sau cùng nhấn cho ̣n OK để kết thúc ta sẽ thu được hình ảnh như hình 2.17.
Hình 2.17. Ảnh sau khi chuyển sang hê ̣ nhi ̣ phân a) Các vết mà phần mềm không thể nhận diê ̣n được
b) Các vết bi ̣ dính vào nhau b’) Các vết bi ̣ dính sau khi dùng lê ̣nh watershed
Bước 8: Tô đen các vết tròn còn chưa kín.
Cho ̣n Process Binary Fill Hole để tô đen các lỗ tròn. Tuy nhiên, vẫn còn tồn ta ̣i mô ̣t số vết mà phần mềm không nhâ ̣n diê ̣n được (hình 2.17a). Cho ̣n ProcessBinary Watershed để ta ̣o đường phân cách cho các vết bi ̣ dính vào nhau (hình 2.17b và 2.17b’).
a
27
Bước 9: Phân tích và đếm các vết trong ảnh.
Cho ̣n Analyze Analyze Particles xuất hiê ̣n cửa sổ Analyze Particles
(như hình 2.18).
Hình 2.18. Cửa sổ Analyze Partisles
Ta ̣i ô Size (pixel^2) nhâ ̣p vào kích thước của vết mà ta muốn đếm.
Ta ̣i ô Circularity nhâ ̣p vào mức đô ̣ gần tròn của vết là chấp nhâ ̣n được (ở đây ta chấp nhâ ̣n các vết có da ̣ng gần tròn từ 80% trở lên).
Ta ̣i ô Show cho ̣n Outlines để hiển thi ̣ đường bao quanh các vết mà phần mềm nhâ ̣n diê ̣n được (như hình 2.19).
Cho ̣n Summarize để hiển thi ̣ số đếm tổng của mỗi vùng.
Cho ̣n Display results để hiển thi ̣ kết quả phân tích chi tiết của từng vết. Cho ̣n Clear results để xóa kết quả cũ khi ta phân tích các hình mới. Cuối cùng nhấn OK.
28
Hình 2.19. Các vết mà phần mềm nhận diê ̣n được trên một phần của ảnh
2.4. Ghi nhâ ̣n vết radon bằng mica
Sau khi khảo sát khả năng ghi nhâ ̣n vết alpha phát ra từ nguồn chuẩn 226Ra củ a mica. Ta tiếp tu ̣c dùng loa ̣i vâ ̣t liê ̣u này để ghi nhâ ̣n vết của khí 222Rn được nhốt trong bình kín.
2.4.1. Giá chứa mẫu mica
Để ta ̣o ra sự tương đồng về vùng chiếu của mẫu mica trong thí nghiê ̣m này với các thí nghiê ̣m khảo sát khả năng ghi nhâ ̣n alpha của mica, ta che kín các mă ̣t của mẫu và chỉ để mô ̣t vùng tròn (tương tự hình 2.4b) trên mẫu phơi chiếu bởi alpha do khí 222Rn phát ra.
Giá được gắn với nắp bình chứa. Trên mỗi giá có thể gắn được 6 mẫu lần lượt cách nắp những khoảng cách khác nhau (như hình 2.20).
2.4.2. Bình nhốt khí 222Rn phá t ra từ nguồn chuẩn 226Ra (9Ci)
Bình nhốt khí là bình bằng thủy tinh có nắp bằng kim loa ̣i. Bình có da ̣ng hình tru ̣ cao 28cm và có dung tích là 2,1lít. Để tránh khí 222Rn rò rỉ ra bên ngoài bình, ta bo ̣c thêm mô ̣t lớp nhôm ở miê ̣ng bình. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
29
2.4.3. Bố trí thí nghiê ̣m
Đầu tiên các mẫu đầu dò được cố đi ̣nh trên giá gắn với nắp của bình nhốt khí
222Rn. Sau đó đă ̣t nguồn 226Ra nằm ngang ở đáy bình như hình 2.20.
Hình 2.20. Bố trí thí nghiê ̣m đo 222Rn bằng mica
Trong thí nghiê ̣m được bố trí như hình 2.20, ta để nguồn 226Ra nằm ngang để tránh ảnh hưởng của các tia alpha phát ra từ nguồn 226Ra. Do mẫu được treo ở bên trên nên các tia alpha mà chúng ghi nhâ ̣n được là do khí 222Rn khuếch tán trong bình phân rã phát ra.
Sau 3 giờ , các mẫu đầu dò mica được đem đi xác đi ̣nh đi ̣nh số vết mà ha ̣t alpha để la ̣i trên bề mă ̣t của nó. Từ đó, tìm được mối tương quan giữa mâ ̣t đô ̣ vết trên mica và nồng đô ̣ khí 222Rn trong bình.
Nguồn 226Ra 9Ci
Các mẫu mica gắn trên giá
30
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khả năng ghi vết alpha của mica
Tiến hành ghi nhâ ̣n sự tồn ta ̣i của tia alpha phát ra từ nguồn chuẩn 226Ra có hoa ̣t đô ̣ 9Ci vớ i các thí nghiê ̣m được bố trí như đã trình bày trong chương 2, ta có thể quan sát được hình da ̣ng vết của ha ̣t alpha trên bề mă ̣t mica như hình 3.1.
Hình 3.1. Vết của hạt alpha do 226Ra phá t ra khi chiếu mẫu mica trong 30s
Từ các hình ảnh ban đầu của bề mă ̣t mica sau khi được phơi chiếu bởi nguồn
226Ra, ta nhận thấy vâ ̣t liê ̣u này có khả năng ghi nhâ ̣n được vết alpha khá tốt, phù hợp với mu ̣c đích đã đề ra.
31
3.2. Khả năng đếm vết của phần mềm Image J
Tiến hành xử lý các hình ảnh thu được từ hê ̣ kính hiển vi NHV-CAM bằng hai phương pháp là phương pháp phân tích bằng phần mềm Image J và phương pháp đếm vết thủ công theo cách truyển thống, ta thu được số đếm của mỗi mẫu (tổng số đếm của 28 vùng). Số đếm mỗi mẫu đo là số đếm trung bình của 3 lần đếm (như bảng 3.1).
Bảng 3.1. Số vết alpha ghi được ứ ng với các thời gian chiếu khác nhau bằng phương pháp dùng phần mềm và đếm thủ công
Thời gian chiếu [s]
Số vết ghi nhâ ̣n bằng Image J
[vết]
Mâ ̣t đô ̣ vết ghi nhâ ̣n bằng
Image J [vết/m3]
Số vết ghi nhâ ̣n bằng đếm thủ công
[vết] 30 5787 58 6,8.1010 6592 81 45 6687 67 7,9.1010 7921 123 60 9494 95 11,2.1010 10287 79 80 8315 83 9,8.1010 9506 75 105 6007 60 7,1.1010 6489 48 120 6483 65 7,6.1010 7999 152 135 6082 61 7,2.1010 6816 73 150 9500 95 11,2.1010 11173 167
Bảng 3.1 trình bày các kết quả ghi nhâ ̣n số vết alpha ứng với các thời gian chiếu khác nhau bằng phần mềm Image J và bằng phương pháp đếm thủ công. Dựa vào bảng số liê ̣u ta thấy có sự chênh lê ̣ch nhe ̣ giữa số đếm thu được bằng phần mềm và số đếm thu được bằng đếm thủ công. Sự khác nhau về số đếm thu được từ hai phương pháp này là do phần mềm Image J chỉ có thể nhâ ̣n diê ̣n được các vết có da ̣ng tròn. Vì thế phần mềm sẽ bỏ sót các vết có da ̣ng gần tròn, trong khi phương pháp đếm thủ
32 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
công la ̣i có thể đếm các vết này. Để thấy được quy luâ ̣t của sự chênh lê ̣ch trên, ta biểu diễn các số liê ̣u trên lên đồ thi ̣ như hình 3.2.
Hình 3.2. Đồ thi ̣ biểu diễn sự so sánh số vết đếm của mẫu mica chiếu bởi 226Ra bằng phần mềm Image J và đếm thủ công
Đồ thi ̣ hình 3.2 cho thấy mối quan hê ̣ tuyến tính giữa số vết đếm được bằng phương pháp thủ công và bằng phần mềm theo hàm (3.1) với hê ̣ số tương quan lên đến 95,5%.
y = ax (3.1)
Hơn nữa, viê ̣c sử du ̣ng phần mềm sẽ rút ngắn thời gian đếm vết từ khoảng 2 giờ mỗi mẫu xuống còn khoảng 20 phút cho mỗi mẫu. Thêm vào đó, kết quả thu được từ phần mềm rất ổn đi ̣nh với sai số giữa các lần đếm là 1%. Trong khi đó, số vết đếm được trên mỗi đầu dò bằng phương pháp đếm thủ công truyền thống phu ̣ thuô ̣c rất nhiều vào sự chủ quan của người đếm.
y = 1,1432x R² = 0,955 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 Thủ công [ vế t] Image J [vết]
33
3.3. Đo nồng độ radon trong bình kín bằng mica
Tiến hành ghi nhâ ̣n vết alpha của khí 222Rn theo bố trí đã nêu ở chương 2, ta thu được kết quả ghi ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Số vết alpha ghi được ứng với các khoảng cách khác nhau so với nguồn
Khoảng cách tới nguồn phát 222Rn
[m]
Số vết ghi nhâ ̣n bằng
Image J [vết]
Mâ ̣t đô ̣ vết thực nghiê ̣m [vết/m3] Mâ ̣t đô ̣ ha ̣t lý thuyết [hạt/m3] 0,13 5389 54 2,9.108 3,6.1012 0,15 4966 50 2,3.108 3,2.1012 0,18 4315 43 1,7.108 2,7.1012 0,21 3515 35 1,2.108 2,3.1012