2.3.2.1.Phương pháp đếm thủ công
Dựa vào hình ảnh các vết mà ha ̣t alpha trên mica chu ̣p được từ kính hiển vi, các vết này sẽ được ghi nhâ ̣n và thống kê tổng số đếm trên 28 vùng của mỗi mẫu.
Thực hiê ̣n đếm thủ công từng vết trên các tấm ảnh là viê ̣c làm tốn nhiều thời gian và công sức. Trung bình ta mất khoảng 3 - 5 phút để xử lý mô ̣t tấm ảnh có khoảng 200 số đếm, mỗi mẫu có 28 vùng đồng nghĩa với ta phải xử lý 28 tấm ảnh và mất khoảng 1,5 - 2 giờ để xử lý mô ̣t mẫu. Thêm vào đó, số lượng vết đếm được bằng cách thủ công còn phu ̣ thuô ̣c vào tra ̣ng thái của người đếm. Vì vâ ̣y, khóa luâ ̣n này đề xuất sử du ̣ng phần mềm Image J để đếm các vết trong các ảnh bề mă ̣t mica thu được từ kính hiển vi.
21 22 23 24 25 26 27 28 15 16 17 18 19 20 9 10 11 12 13 14 4 5 6 7 8 1 2 3
21
2.3.2.2.Phương pháp đếm vết bằng phần mềm Image J
Image J là phần mềm mã nguồn mở được phát triển bởi Viê ̣n Y tế quốc gia Hoa Kỳ (go ̣i tắt là NIH). Phần mềm này thường được dùng để phân tích băng trên gel trong sinh ho ̣c, đi ̣nh lượng các tín hiê ̣u từ kính hiển vi,… Người dùng có thể tự cải tiến các tính năng của phần mềm nếu không muốn sử du ̣ng các gói mà phần mềm hỗ trợ sẵn bằng ngôn ngữ lâ ̣p trình Java.
Ưu điểm của phần mềm:
Có thể mở rô ̣ng các tính năng bằng plug-in.
Cho phép chồng các ảnh lên nhau.
Phân tích và đếm các tế bào, đếm vết trên ảnh.
Cho phép du ̣ng hình ảnh 3D từ các ảnh 2D ban đầu.
Nhược điểm: mô ̣t trong những nhược điểm lớn nhất của Image J là các vết có đường bao bên ngoài không khép kín thì phần mềm không thể nhâ ̣n diê ̣n là mô ̣t vết.
Để đếm các vết bằng phần mềm Image J ta thực hiê ̣n các bước sau:
Bước 1: Khởi đô ̣ng phần mềm Image J (hình 2.10) và mở hình ảnh cần xử
lý.
Hình 2.10. Giao diê ̣n chính của phần mềm Image J
Bước 2:Khớp kích thước thâ ̣t của ảnh với kích thước của phần mềm. Cho ̣n lê ̣nh Straight rồi vẽ mô ̣t đường thằng nằm ngang (màu vàng) từ mép này đến mép kia của ảnh (như hình 2.11).
22
Hình 2.11. Thao tác với lê ̣nh Straight
Sau đó cho ̣n Analyze Set Scale cửa sổ Set Scale (như hình 2.12).
Hình 2.12. Cửa sổ Set Scale
23
Ta ̣i ô Distance in pixels chỉ đô ̣ dài tính bằng pixel của đoa ̣n thẳng mà ta vừa vẽ trên hình.
Ta ̣i ô Known distance ta nhâ ̣p kích thước thâ ̣t ảnh (ở đây là bề ngang của tấm ảnh 1mm = 1000m).
Ta ̣i ô Unit of length ta nhâ ̣p đơn vi ̣ đo chiều dài mà ta muốn (ở đây là micromet nên ta nhâ ̣p micron). Cho ̣n đơn vi ̣ chuẩn là micromet vì các ha ̣t có kích thước cỡ micromet.
Chọn Global để mă ̣c đi ̣nh tỉ lê ̣ này cho tất cả các tấm ảnh ta sẽ xử lý phía sau rồi cho ̣n OK.
Bước 3:Loa ̣i bỏ nền bằng cách cho ̣n Process Subtract Background
cửa sổ Subtract Background (như hình 2.13) sẽ xuất hiê ̣n.
Hình 2.13. Cửa sổ Subtract Background
Ta ̣i ô Rolling ball radius nhâ ̣p vào bán kính của ha ̣t tính bằng pixel (ở đây ta cho ̣n những vết có kích thước cỡ 20 pixels). Những ha ̣t nào có bán kính lớn hơn kích thước ta nhâ ̣p vào sẽ được xem như nền và sẽ bi ̣ loa ̣i bỏ.
Click Light background để hình ảnh sau khi xử lý sẽ có nền trắng. Click Separate colors tách các màu riêng biê ̣t trong hình ra để giảm nhiễu.
24
Có thể click Preview để xem trước kết quả. Cuối cùng nhấn OK.
Bước 4: Lo ̣c những ha ̣t có kích thước trong giới ha ̣n ta quan tâm.
Cho ̣n Process FFT Bandpass Filter Xuất hiê ̣n cửa sổ Bandpass Filter (như hình 2.14).
Hình 2.14. Cửa sổ FFT Bandpass Filter
Ta ̣i ô Filter large structure down to nhâ ̣p vào kích thước tối đa của ha ̣t tính bằng pixel (ở đây ta quan tâm các ha ̣t có kích thước tối đa là 15 pixels). Ta ̣i ô Filter small structure up to nhâ ̣p vào kích thước tối đa của ha ̣t tính bằng pixel (ở đây ta quan tâm các ha ̣t có kích thước tối đa là 15 pixels).
Ta ̣i ô Tolerance of direction nhâ ̣p vào sai số của kích thước ha ̣t (ở đây ta cho ̣n sai số 1%).
Sau đó nhấn OK.
Bước 5:Chỉnh cho ảnh về thang đô ̣ xám 8-bit. Cho ̣n Image Type 8-bit
25
Bước 6: Đă ̣t ngưỡng để tăng khả năng phân biê ̣t giữa vết của alpha và các vết khác. Cho ̣n Image Adjust Threshold Xuất hiê ̣n cửa sổ
Threshold (như hình 2.15). Sau đó, kéo cho ̣n ngưỡng thích hợp (ta thường sẽ cho ̣n ngưỡng mă ̣c đi ̣nh của phần mềm) rồi nhấn Apply.
Hình 2.15. Cửa sổ Threshold
Bước 7: Chuyển ảnh sang hê ̣ nhi ̣ phân, ứng với hai giá tri ̣ trắng và đen.
Cho ̣n ProcessBinary Make Binary Xuất hiê ̣n cửa sổ Make Binary
(như hình 2.16).
26
Thresholded pixels to foreground color: quan tâm tất cả các điểm ảnh nằm trong ngưỡng đã cho ̣n ở bước trên.
Remaining pixels to foreground color: các điểm ảnh nằm ngoài ngưỡng đã cho ̣n sẽ không quan tâm tới nữa.
Black foreground, white background: phần màu đen là phần mà ta quan tâm, phần màu trắng là nền.
Sau cùng nhấn cho ̣n OK để kết thúc ta sẽ thu được hình ảnh như hình 2.17.
Hình 2.17. Ảnh sau khi chuyển sang hê ̣ nhi ̣ phân a) Các vết mà phần mềm không thể nhận diê ̣n được
b) Các vết bi ̣ dính vào nhau b’) Các vết bi ̣ dính sau khi dùng lê ̣nh watershed
Bước 8: Tô đen các vết tròn còn chưa kín.
Cho ̣n Process Binary Fill Hole để tô đen các lỗ tròn. Tuy nhiên, vẫn còn tồn ta ̣i mô ̣t số vết mà phần mềm không nhâ ̣n diê ̣n được (hình 2.17a). Cho ̣n ProcessBinary Watershed để ta ̣o đường phân cách cho các vết bi ̣ dính vào nhau (hình 2.17b và 2.17b’).
a
27
Bước 9: Phân tích và đếm các vết trong ảnh.
Cho ̣n Analyze Analyze Particles xuất hiê ̣n cửa sổ Analyze Particles
(như hình 2.18).
Hình 2.18. Cửa sổ Analyze Partisles
Ta ̣i ô Size (pixel^2) nhâ ̣p vào kích thước của vết mà ta muốn đếm.
Ta ̣i ô Circularity nhâ ̣p vào mức đô ̣ gần tròn của vết là chấp nhâ ̣n được (ở đây ta chấp nhâ ̣n các vết có da ̣ng gần tròn từ 80% trở lên).
Ta ̣i ô Show cho ̣n Outlines để hiển thi ̣ đường bao quanh các vết mà phần mềm nhâ ̣n diê ̣n được (như hình 2.19).
Cho ̣n Summarize để hiển thi ̣ số đếm tổng của mỗi vùng.
Cho ̣n Display results để hiển thi ̣ kết quả phân tích chi tiết của từng vết. Cho ̣n Clear results để xóa kết quả cũ khi ta phân tích các hình mới. Cuối cùng nhấn OK.
28
Hình 2.19. Các vết mà phần mềm nhận diê ̣n được trên một phần của ảnh