Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.3.Xácđịnh lại kiểu gen Type1 bằng phƣơng pháp giải tình tự gen (Sequencing) trên đoạn NS5B.
(Sequencing) trên đoạn NS5B.
Đối với hệ mồi và mẫu dị trên vùng 5’NC của HCV thiết kế thí nghiệm sử dụng RNA chứng dương là HCV genotype 1 được đưa vào hỗn hợp cho phản ứng revers transcription RT- PCR chứa các probe đặc trưng cho HCV genotype 1,2,3 và 6. Việc bố trí thí nghiệm cũng được tiến hành tương tự cho các genotype còn lại. Kết quả chỉ có hỗn hợp chứa mẫu dị Probe 1 đặc trưng cho HCV genotype 1 mới cho tín hiệu dương tính. Kết quả tương tự cho các genotype cịn lại (Hình 3.6)
HCV genotype 1 HCV genotype 3 HCV genotype2 HCV genotype 6
Chứng âm
Hình 3.6 Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của mồi và mẫu dị trên vùng 5’NC của HCV
Hình 3.6 cho thấy các phản ứng nếu có các kiểu gen tương ứng với các mẫu dị đặc trưng thì các tín hiệu huỳnh quang vượt trên tín hiệu nền, các mẫu chứng âm (được thiết kế với các thành phần tương tự cho phản ứng real-time PCR và real-time RT PCR) có tín hiệu huỳnh quang thấp hơn tín hiệu nền.
Tuy nhiên trong 228 bệnh phẩm xác định genotype HCV có 59 trường hợp kết quả cho hai tín hiệu dương tính đặc trưng cho HCV genotype 1 và 6 (Hình 3.7).
45
Hình 3.7 Tín hiệu dƣơng tính genotype 1 và 6
Vậy tín hiệu mẫu dị giữa type 1 và type 6 là có sự tương đồng cao.Theo một số nhà nghiên cứu trên thế giới [18] chứng minh là nếu định genotype HCV trên vùng NS5B thì sẽ phân biệt các subtype tốt hơn là dựa trên vùng 5’NC, cũng như là phân biệt được type 6 với subtype 1b.
Trong số 151 mẫu của bệnh nhân đã xác định là genotype l ta l ấy ngẫu nhiên 30 trường hợp đem giải trình tự gen trên đoạn NS5b được kết quả như bảng sau:
Bảng 3.7 Kết quả giải trình tự gen trên đoạn NS5b của HCV Kiểu
gen
Type 1 Type 6 Không
xác định được
Type 1a Type 1b Type 6k Type 6e Type 6f Type 6h
Số mẫu 9 7 2 6 1 2 3 Tổng 16 11 3 Tỉ lệ % 53.33 36.67 10.0 Tín hiệu mẫu dị type 6 Tín hiệu mẫu dị type 1 Tín hiệu mẫu dị type 2 Tín hiệu mẫu dị type 3
46
Trong 30 mẫu giải trình tự gen có 16 mẫu huyết thanh là type 1 và 11 mẫu huyết thanh xác định là type 6 và có 3 mẫu là khơng giải được trình tự gen, khơng chỉ xác định type mà giải trình tự gen cịn xác định đến subtype. Như vậy có 11 mẫu huyết thanh định type bằng phương pháp RT- PCR dùng taqman probe gắn huỳnh quang FAM phát hiện genotype HCV cho tín hiệu dương tính với genotype 1 cịn phương pháp giải trình tự gen cho kết quả là type 6, trong đó có 2 mẫu là type 6k, 6 mẫu là type 6e, 1 mẫu là type 6f và 2 mẫu là type 6h (Bảng 3.7 ).
Kết quả định type bằng kỹ thuật RT- PCR cho tín hiệu dương tính với genotype1 ta đem giải trình tự được kết quả như hình dưới,kết quả giải trình tự gen là type 6h (Hình 3.8). 78 HCV GAGGTACTTGCCACATATTGCGGCTTTCCCTCCTTGGGCGATAAGTTTGGCCCTGACCGCTCGGGCTC GGTGTCTCCAAGCTCTCAAGGGAGGAGCCCCAAGTTTTCTGAGGCATGATGCCACCCGATTGAGTTCGCCG GGAGAGTACCCATGGAGTGAGAATGCGGCCATGCCGTGGAGTCTTTGAATGATCACTGGGAGATCAAGCG GAGTGATTGAATATGTGACTCCGTAGATATCGAAGTCAAGTGCCCTGTCCAAAGTCTCCTGTGCCTGGAGT ATTTGAAAGAAATGGGTCATGAGTACCATACGCACCCAAATGGTGGGGGCATACATAATGATGTTCCCTAA CCATGAATTCACAGGAGTGTGGCGAGCGGTCTCCCAGGCCGCCCTCGCCAGTGGAGTGACAGGGTCACGA GTGAGGTAGTAATATCTTCTGCCGTCTCCATCGTGGGCCACGGAAACATTGGATGAGCATGATGTTA
Hình 3.8 Kết quả giải trình tự gen trên đoạn NS5b
Trong 3 mẫu khơng giải trình tự gen được thì có 2 mẫu có ARN-HCV thấp nhất là 1,1x102 và 4,2x102 và có 1 mẫu là 5,8x103. Như vậy tuy giải trình tự gen có xác
47
định kết quả chính xác đến subtype tránh được sự nhầm lẫn giữa type 1 và type 6
nhưng nếu định lượng ARN-HCV có số copies< 103
thì ta khơng định được type, điều này cũng được các nhà sản xuất bộ kit và hóa chất khuyến cáo.
Ta thấy rằng tỉ lệ nhầm lẫn giữa type 1 và type 6 trong 30 mẫu định type bằng phương pháp Real-time PCR với phương pháp giải trình tự gen là 11/27 mẫu bằng 40,74%.
Như vậy định type bằng phương pháp Real-time PCR xét về mặt kinh tế thì phù hợp với đa số điều kiện của bệnh nhân, tuy nhiên không xác định được subtype và tỉ lệ nhầm lẫn giữa type 1 và type 6 là 40,74% vì vậy sẽ ảnh hưởng đến kết quả điều trị của bệnh nhân,do các genotype HCV có sự khác nhau về độc lực, khả năng gây bệnh và khả năng đáp ứng điều trị và genotype 1 thường đáp ứng thấp hơn với các genotype khác (Genotype 1 thường điều trị trong vòng 48 tuần còn các genotype khác điều trị trong 24 tuần). Do đó bệnh nhân khi đã xác định là type 1 bằng phương pháp RT- PCR và có kết quả định lượng >103copies/ml nên kiểm tra lại bằng phương pháp giải trình tự gen.
48
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});