Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.3.Kỹ thuật Real-time PCR sử dụng Taqman Probe phát hiện và đinh lượng HCV-RNA.
lượng HCV-RNA.
Các bước tiến hành
Sau khi tách chiết RNA ta tổng hợp cDNA sử dụng NKcDNAsynthesis kit để
thực hiện phản ứng revers transcription với mồi ngẫu nhiên phiên mã ngược RNA trong các dịch trích biệt RNA ở trên (mẫu bệnh phẩm và mẫu chứng âm) thành cDNA. Cho vào PCR mix để chuẩn bị chạy PCR.
Phải thực hiện giai đoạn này với các PCR mix giữ trong khay lạnh hay đá bào
Cho PCR mix vào low-profile white PCR tube: Tính tốn số phản ứng cần phải
thực hiện để lấy đủ số tube chứa master mix vào tube PCR. Để các tube Master mix ở 40
C-100C trong tối cho đến khi rã đơng hồn tồn; lăc nhẹ để trộn sau đó li tâm
nhẹ để lắng. Cho vào các tube PCR, mỗi tube 20𝜇l NKHCV-TQPCRHEX mix. Giữ
các tube này trong đá bào hay các giá lạnh.
Đối với mỗi mẫu cDNA từ bệnh phẩm và mẫu chứng âm: cho 5𝜇𝑙 mẫu cDNA
vào một tube PCR chứa 20𝜇𝑙 NKHCV-TQPCRHEX mix.
Đối với các NKHCVDNA chuẩn : cho vào 3 tube PCR khác chứa 20𝜇𝑙 NKHCV-
TQPCRHEX mix, mỗi tube 5𝜇𝑙 một độ pha loãng NKHCVDNA chuẩn.
Chạy real-time PCR
Bật máy real-time PCR ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình luân nhiệt. Cho tất cả các ống PCR mix đã chuẩn bị ở trên vào buồng ủ nhiệt của máy real-time PCR. Chọn plate set-up để chọn vị trí các giếng mà các tube phản ứng được đặt vào. Chọn hai kênh huỳnh quang là “ FAM” và “HEX” phát được huỳnh quang khi các taqman probe tương ứng bị thủy giải, và máy chọn được các kính lọc huỳnh quang tương ứng các camera của máy ghi nhận được các ánh sáng huỳnh quang phát ra.
33
Chọn thể tích phản ứng là 25𝜇𝑙. Sau đó chạy chương trình ln nhiệt real-time PCR như sau: 1 chu kỳ 400C trong 10 phút 1 chu kỳ 950 C trong 5 phút 40 chu kỳ 940 C trong 15 giây 650C trong 1 phút
Chụp hình Real-time ở giai đoạn này.