3.2.1.Kết quả xây dựng khoảng tham chiếu của thông số C14
Hình 3.3: Sự phân bố mức độ C14
Nhận xét: Hình dạng tổng thể của phân phối này lệch sang phải. Sau khi đã loại bỏ các ngoại lệ, n = 5550 nên kiểm nghiệm Kolmogorov-Smirnov được sử dụng để kiểm tra tính chuẩn của dữ liệu.
Bảng 3.3: Kiểm nghiệm tính chuẩn của C14
Kolmogorov-Smirnova
Statistic Df Sig.
C14 0.087 5550 0.000
Nhận xét: Bảng 3.3 cho thấy các giá trị không tuân theo phân phối xác suất chuẩn (p<0.05) nên phương pháp phi tham số được áp dụng. Tất cả các giá trị được sắp xếp theo thứ tự tăng dần và x đại diện cho thứ hạng của một giá trị
(nhỏ nhất x=1). Khoảng tham chiếu với giới hạn dưới x2,5 và giới hạn trên x97,5
được tính tương ứng với 0.025 (n + 1) và 0.975 (n +1): X2,5 = 0.025 * 5551 = 138.78 139 X97,5 = 0.975 * 5482 = 5412.22 5412 Bảng 3.4: Giá trị - tần số của C14 Giá trị Tần số Giá trị Tần số 0.03 4 0.15 422 0.04 10 0.16 371 0.05 16 0.17 315 0.06 42 0.18 255 0.07 255 0.19 224 0.08 248 0.2 175 0.09 343 0.21 135 0.1 452 0.22 110 0.11 456 0.23 96 0.12 497 0.24 52 0.13 499 0.25 56 0.14 480 0.26 37
Nhận xét: Bảng 3.4 giúp xác định giới hạn trên và dưới của nồng độ C14 ở trẻ sơ sinh. Như vậy, khoảng tham chiếu được lấy từ 0.07 umol/l đến 0.24 umol/l. Theo cách tương tự các thông số acylcarnitine còn lại được tính toán và thể hiện trong bảng dưới đây. Dữ liệu của các thông số đều không tuân theo phân phối chuẩn.
Giá trị ở vị trí 139
Giá trị ở vị trí 5412
Bảng 3.5: Kết quả khoảng tham chiếu của các acylcarnitine.
Các chỉ số N Trung bình(umol/l) SD Tối thiểu Tối đa 95% CI (umol/l) tham chiếu (umol/l)Khoảng C0 5458 20.05 5.76 6.19 35.82 19.9 - 20.21 11.18 - 33.09 C2 5490 18.34 5.587 3.89 33.47 18.19 - 18.49 7.34 - 30.67 C3 5394 1.53 0.518 0.22 2.94 1.51 - 1.54 0.65 - 2.68 C4 5509 0.14 0.047 0 0.27 0.138 - 0.14 0.07 - 0.25 C4OH 5474 0.069 0.0335 0 0.16 0.069 - 0.0704 0.02 - 0.15 C5 5449 0.094 0.042 0 0.21 0.092 - 0.095 0.03 - 0.19 C5:1 5670 0.039 0.023 0 0.09 0.0379 - 0.039 0.01 - 0.08 C5OH 5327 0.119 0.048 0 0.24 0.118 - 0.121 0.045 - 0.23 C5DC 5669 0.14 0.071 0 0.37 0.138 - 0.142 0.02 - 0.25 C6 5610 0.037 0.015 0 0.08 0.0369 - 0.038 0.01 - 0.07 C6DC 5455 0.116 0.0497 0 0.25 0.114 - 0.117 0.02 - 0.21 C8 5358 0.033 0.012 0 0.06 0.0325 - 0.033 0.02 - 0.06 C8:1 5570 0.044 0.021 0 0.1 0.0439 - 0.045 0.01 - 0.09 C10 5461 0.041 0.0168 0 0.08 0.0401 - 0.041 0.01 - 0.08 C10:1 5537 0.031 0.0131 0 0.06 0.0302 - 0.031 0.01 - 0.06 C10:2 5663 0.027 0.0189 0 0.08 0.0266 - 0.027 0.01 - 0.08 C12 5511 0.057 0.02 0.01 0.11 0.0568- 0.0579 0.02 - 0.1 C12:1 5438 0.022 0.011 0 0.05 0.0215 - 0.022 0.01 - 0.05 C14 5550 0.139 0.044 0.03 0.26 0.1376- 0.1399 0.07 - 0.24 C14:1 5572 0.074 0.034 0.01 0.17 0.0736- 0.0754 0.02 - 0.15 C14:2 5483 0.016 0.0067 0 0.03 0.0155- 0.0159 0.01 - 0.03 C14OH 5599 0.007 0.0059 0 0.02 0.0067 - 0.007 0 - 0.02 C16 5461 1.98 0.699 0 3.89 1.957 - 1.994 0.85 - 3.48 C16:1 5502 0.135 0.0495 0.02 0.27 0.1334 - 0.136 0.06 - 0.25 C16:1OH 5353 0.024 0.0087 0.01 0.04 0.0238- 0.0243 0.01 - 0.04 C16:OH 4910 0.01 0.003 0 0.03 0 - 0.01 0 - 0.01 C18 5515 0.611 0.198 0.18 1.16 0.606 - 0.616 0.31 - 1.05 C18:1 5524 0.92 0.283 0.11 1.7 0.908 - 0.923 0.47 - 1.55 C18:1OH 4476 0.01 0.002 0 0,02 0 - 0.01 0 - 0.01 C18:2 5431 0.125 0.052 0 0.26 0.1235 - 0.126 0.04 - 0.24 C18OH 4325 0.01 0.001 0 0.02 0 - 0.01 0 - 0.01
Nhận xét: Nhìn chung, các acylcarnitine chuỗi ngắn có nồng độ cao hơn chuỗi dài. Quan sát thấy C0 (20.05 umol/l), C2 (18.35 umol/l) là các acylcarnitine có nồng độ cao nhất trong khi C14OH (0.007 umol/l) có nồng độ thấp nhất. C16 (1.98 umol/l) có nồng độ cao nhất trong số các acylcarnitine chuỗi dài
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN
Giá trị của khoảng tham chiếu là một trong những yếu tố quan trọng nhất để giải thích các xét nghiệm lâm sàng vì khoảng tham chiếu đóng vai trò là điểm chuẩn để so sánh kết quả xét nghiệm của bệnh nhân. Trong mọi trường hợp, khoảng tham chiếu của người lớn không nên được áp dụng cho trẻ em do sự khác biệt lớn về các đặc điểm sinh lý. Sinh lý của trẻ em liên tục phát triển và thay đổi giữa các cá thể. Hiện nay, rối loạn chuyển hóa bẩm sinh là một vấn đề đáng lo ngại và rất cần được quan tâm ở trẻ em. Lỗi bẩm sinh về chuyển hóa đại diện cho một vấn đề sức khỏe cộng đồng quan trọng do những hạn chế về chẩn đoán và điều trị hiện tại, chất lượng cuộc sống của bệnh nhân bị ảnh hưởng nặng nề nếu không được phát hiện bệnh sớm và hậu quả là cái chết của trẻ em. Do đó, nghiên cứu này được thực hiện với mục đích thiết lập khoảng tham chiếu cho xét nghiệm sàng lọc rối loạn chuyển hóa ở trẻ sơ sinh. Trẻ sơ sinh khỏe mạnh đáp ứng đủ các tiêu chuẩn được ghi danh vào nghiên cứu theo phương pháp gián tiếp.
Trái ngược với các phương pháp cổ điển, phép đo phổ khối đôi (MS/MS) đã cho phép đánh giá đồng thời nhiều chất chuyển hóa liên quan đến rối loạn chuyển hóa bẩm sinh chỉ trong một lần xét nghiệm mang lại độ nhạy cao hơn, tỷ lệ dương tính giả thấp và công suất cao. MS/MS đang ngày càng được ủng hộ cho các chương trình sàng lọc sơ sinh mở rộng. MS/MS giúp mở rộng đáng kể khả năng chẩn đoán và điều trị sớm, khi chưa xuất hiện các triệu chứng giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cho trẻ em bị ảnh hưởng. Hạn chế của phương pháp MS/MS là bị ảnh hưởng bởi mẫu máu khô và nồng độ hematocrit. Người ta đã đề xuất rằng tính toàn vẹn của các đốm máu khô có thể bị tổn hại trong một khung thời gian ngắn bởi độ ẩm và nhiệt
độ trong quá trình vận chuyển mẫu, sự suy giảm đáng kể của acid amin và acylcarnitine trong điểm máu ở nhiệt độ cao (45°C) và độ ẩm (> 70%), đặc biệt trong ngày đầu tiên lưu trữ [34]. Do đó, điều kiện vận chuyển và lưu trữ phải được kiểm soát. Ngoài ra vị trí cắt trên đốm máu khô cũng làm ảnh hưởng đến nồng độ một số chất phân tích. Cắt ở rìa đốm máu có thể làm tăng 35% nồng độ một số chất so với vị trí cắt ở trung tâm đốm máu [35]. Hầu hết các chất chuyển hóa được sử dụng để sàng lọc trẻ sơ sinh bị ảnh hưởng bởi hematocrit [35] mà nồng độ hematocrit ở trẻ sơ sinh là rất khác nhau (45- 60%). Do đó, để giảm thiểu sai lệch phân tích, các biến này cần được kiểm soát và điều chỉnh phù hợp.
Chúng tôi đã thu được các giá trị của các mẫu thông qua kỹ thuật phân tách và định lượng các ion bằng máy LCMS-8040. Các phép đo được tiến hành đạt tiêu chuẩn , độ tin cậy và độ ổn định lâu dài, với chương trình QC đủ điều kiện với các tiêu chí rõ ràng. Việc phân tích dữ liệu bắt đầu sau khi tất cả các phép đo hoàn thành đảm bảo máy đạt chuẩn. Có hai phương pháp là tham số và phi tham số được áp dụng để rút ra các giới hạn tham chiếu. Trong phương pháp tham số, hai giới hạn của khoảng tham chiếu được xác định bằng cho phân phối xác suất chuẩn. Trong phương pháp phi tham số, phép tính được sử dụng phức tạp hơn. Tất cả các giá trị được sắp xếp tăng dần từ x1, x2,…xn. Sau đó, phân vị thứ 2,5 và phân vị thứ 97,5 được tính tương ứng là giới hạn trên và giới hạn dưới. Cụ thể, chúng tôi đã hiển thị kết quả của các thông số trong bảng 3.2, bảng 3.5.
Kết quả cho thấy, nồng độ acylcarnitine thấp hơn nhiều so với nồng độ của các axit amin. Điều này là phù hợp với chức năng hoạt động của chúng trong cơ thể. Acid amin là sản phẩm của quá trình chuyển hóa protein, trong khi acylcarnitine có nguồn gốc từ quá trình oxy hóa của nhiều loại nhiên liệu
trao đổi chất, bao gồm nổi bật là oxy hóa acid béo. Acyl Carnitines có vai trò vận chuyển các acid béo chuỗi dài vào ty thể. Mặc dù thường được coi là các con đường riêng biệt, các mạch acid amin và acib béo ngày càng được xem xét song song.
Chúng tôi tiến hành so sánh kết quả của chúng tôi với một nghiên cứu khác ở Colombia được thực hiện bởi N Céspedes và cộng sự. Đối tượng nghiên cứu của họ là tương tương với nghiên cứu của chúng tôi và sử dụng cùng một phương pháp – phương pháp phổ khối đôi. KTC của chúng tôi ở hầu hết các thông số acid amin và acylcarnitine đều hẹp hơn khá nhiều so với KTC của Colombia.
Bảng 4.5: So sánh nồng độ acid amin của trẻ sơ sinh Việt Nam trong nghiên cứu này và nghiên cứu của Colombia [36]
Các chỉ số
Việt Nam Colombia
Trung bình (umol/l) SD Khoảng tham chiếu (umol/l) Trung bình (umol/l) SD Khoảng tham chiếu (umol/l) Ala 181.87 58.14 90.06 - 314.44 192.01 53.86 91.43 - 348.82 Arg 3.66 1.48 1.54 - 7.12 19.94 11,48 4.4 - 32.07 Cit 8.85 2.65 4.3 - 14.52 14.95 4.56 7.81 - 27.52 Leu 98.81 26.29 54.61 - 155.57 246.72 1212.16 72.61 - 536.72 Met 17.66 5.118 8.73 - 28.63 35.5 19.71 11 - 101.91 Phe 45.76 10.74 27.82 - 68.82 44.27 11.78 23.92 - 78.94 Tyr 43.34 20.08 14.06 - 88.91 96.27 34.72 37.03 - 201.25 Val 79.29 19.74 46.47 - 123.8 128.42 32.1 59.18 – 204
Bảng 4.6: So sánh nồng độ acylcarnitine của trẻ sơ sinh Việt Nam trong nghiên cứu này với nghiên cứu của Colombia [36]
Các chỉ số
Việt Nam Colombia Trung bình (umol/l) SD Khoảng tham chiếu (umol/l) Trung bình (umol/l) SD Khoảng tham chiếu (umol/l) C0 20.05 5.76 11.18 - 33.09 32.39 13.71 13.63 – 78.74 C2 18.34 5.587 7.34 - 30.67 22.69 8.62 9.02 – 54.31 C3 1.527 0.518 0.65 - 2.68 1.24 0.73 0.23 – 4.05 C4 0.139 0.047 0.07 - 0.25 0.22 0.15 0.07 – 0.64 C5 0.094 0.042 0.03 - 0.19 0.24 0.09 0.09 – 0.59 C5DC 0.14 0.071 0.02 - 0.25 0.12 0.07 0.03 – 0.36 C6 0.037 0.015 0.01 - 0.07 0.16 0.09 0.04 – 0.51 C8 0.033 0.012 0.02 - 0.06 0.16 0.08 0.05 – 0.43 C10 0.041 0.0168 0.01 - 0.08 0.17 0.09 0.05 – 0.45 C12 0.057 0.02 0.02 - 0.1 0.27 0.16 0.08 – 0.81 C14 0.139 0.044 0.07 - 0.24 0.32 0.15 0.1 – 0.84 C16 1.98 0.699 0.85 - 3.48 2.48 1.19 0.72 – 6.17 C16:OH 0.01 0.003 0 - 0.01 0.1 0.06 0.02 – 0.27 C18 0.611 0.198 0.31 - 1.05 0.83 0.36 0.3 – 2.0 C18OH 0.01 0.001 0 - 0.01 0.07 0.05 0.02 – 0.26
Quan sát thấy nồng độ acid amin và acylcarnitine của trẻ sơ sinh Việt Nam thấp hơn Colombia nguyên nhân đầu tiên phải kể đến là sự khác biệt về số ngày tuổi của đối tượng nghiên cứu. Trong nghiên cứu của Colombia đối tượng được chọn là trẻ sơ sinh từ 1 đến 18 ngày tuổi còn trong nghiên cứu của Việt Nam đối tượng được chọn là trẻ sơ sinh 24 đến 72 giờ tuổi. Tuổi tác có ảnh hưởng đáng kể đến nồng độ chất phân tích. Nồng độ acylcarnitine
trong các mẫu máu khô đặc trưng bởi sự giảm nồng độ khi còn nhỏ phù hợp với các nghiên cứu trước đây. Ngoài ra, sự khác biệt về vị trí địa lý, chế độ dinh dưỡng của mẹ bầu Việt Nam thấp hơn cũng làm nồng độ acid amin và acylcarnitine của trẻ sơ sinh Việt nam thấp hơn so với trẻ sơ sinh ở Colombia.
Sau khi xây dựng được khoảng tham chiếu cho xét nghiệm sàng lọc rối loạn chuyển hóa thì việc dựa vào KTC đó để đưa ra kết quả sàng lọc sao cho hạn chế thấp nhất dương tính giả và âm tính giả là rất quan trọng. Do đó, bước tiếp theo của xây dựng giá trị tham chiếu là xây dưng giá trị ngưỡng giúp đưa ra kết quả sàng lọc dương tính. Giá trị ngưỡng là giá trị quyết định độ nhạy và độ chuyên biệt của xét nghiệm. Sử dụng biểu đồ đường cong ROC (Receiver operation characteristic) để xây dựng các giá trị ngưỡng. ROC cho thấy tỷ lệ dương tính thật (độ nhạy) và tỷ lệ dương tính giả (độ chuyên biệt) trên cùng một biểu đồ. Để chọn được giá trị ngưỡng thích hợp người ta căn cứ vào các phí tổn gây ra do dương tính giả và âm tính giả.
Nghiên cứu của chúng tôi vẫn còn một số hạn chế như cỡ mẫu còn nhỏ và KTC được xây dựng chỉ đại diện cho quần thể trẻ sơ sinh Việt Nam.
KẾT LUẬN
Khoảng tham chiếu của 42 thông số acid amin và acylcarnitine ở trẻ sơ sinh đã được thiết lập bằng phương pháp MSMS. Từ đó ứng dụng cho việc sàng lọc chuyển hóa ở trẻ sơ sinh Việt Nam một cách có hiệu quả.
1. J.O Westgard (2009), Basic Method Validation, Westgard QC 7614 Gray For Trail, Madison.
2. Horowitz G.L, Altale S, Ceriotti F et al (2010), Defining, Establishing, and Verifying Reference Intervals in the Clinical Laboratory: Approved Guideline. CLSI document C28-A3, Third edition, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne.
3. “Inborn errors of metabolism”: MedlinePlus Medical Encyclopedia 4. Sanderson S, Green A, Preece MA, Burton H (2016). The incidence of
inherited metabolic disorders in the West Midlands, UK. Arch Dis Child; 91 :896–9.
5. Subir Kumar Das (October 2013). “Inborn Errors of Metabolism: Challenges and Management”.
6. "MeSH Descriptor Data: Metabolic diseases". National Library of Medicine.
7. James, William D. Berger, Timothy G.; et al. (2006). Andrews’ Diseases of the Skin: clinical Dermatology.
8. Van Wegberg AMJ, MacDonald A et al ( 2017 Oct 12): “ The complete European guidelines on phenylketonuria: diagnosis and treatment”. 9. Blackburn PR et al. Appy Clin Genet ( 2017 Sep 6): “ Maple syrup
urine disease: mechanisms and management”.
10. Brul, S.; Westerveld, A.; Strijland, A.; Wanders, R.; Schram, A.; Heymans, H.; Schutgens, R.; Van Den Bosch, H.; Tager, J. (June 1988). "Genetic heterogeneity in the cerebrohepatorenal (Zellweger) syndrome and other inherited disorders with a generalized impairment of peroxisomal functions. A study using complementation analysis". Journal of Clinical Investigation. 81 (6): 1710–1715
biochemistry. January 2011
13. Chace DH, Kalas TA, Naylor EW (2003). Use of tandem mass spectrometry for multianalyte screening of dried blood specimens from newborns. Clin Chem;49(11):1797 – 1817.
14. Therrell BL, Padilla CD, Loeber JG, el al (2015). Current status of newborn screening worldwide 2015. Semin Perinatol;39(3):171–187 15. Millington DS, Roe CR, Maltby DA (1984). Application of high
resolution fast atom bombardment and constant B/E ratio linked scanning to the identification and analysis of acylcarnitines in metabolic disease. Biomed Mass Spectrom;11(5):236–241.
16. Millington DS, Norwood DL, Kodo N, el al (1989). Application of fast atom bombardment with tandem mass spectrometry and liquid chromatography/mass spectrometry to the analysis of acylcarnitines in human urine, blood, and tissue. Analyt Biochem;180(2):331–339
17. Chace DH, Sherwin JE, Hillman SL, el al (1998). Use of phenylalanine-to-tyrosine ratio determined by tandem mass spectrometry to improve newborn screening for phenylketonuria of early discharge specimens collected in the first 24 hours. Clin Chem;44(12):2405–2409.
18. Jensen UG, Brandt NJ, Christensen E, el al (2001). Neonatal screening for galactosemia by quantitative analysis of hexose monophosphates using tandem mass spectrometry a retrospective study. Clin Chem;47(8):1364–1372.
19. Raghuveer TS, Garg U, Graf WD (2006). Inborn errors of metabolism in infancy and early childhood an update. Am Fam Physician;73(11):1981–1990
21. Schulze A, Lindner M, Kohlmüller D, el al (2003). Expanded newborn screening for inborn errors of metabolism by electrospray ionization- tandem mass spectrometry results, outcome, and implications. Pediatrics;111(6):1399–1406.
22. Couce ML, Castiñeiras DE, Bóveda MD, el al (2011). Evaluation and long-term follow-up of infants with inborn errors of metabolism identified in an expanded screening programme. Mol Genet Metab;104(4):470–475.
23. Torres-Sepúlveda MdR, Martínez-de Villarreal LE, Esmer C, González- Alanís R, Ruiz-Herrera C, Sánchez-Peña A A. Tamiz metabólico neonatal por espectrometría de masas en tándem dos años de experiencia en Nuevo León, México. Sal Públ Méx. 2008;50(3):200– 206
24. Borrajo GJ. Newborn screening in Latin America at the beginning of the 21st century. J Inherit Metab Dis. 2007;30(4):466–481.
25. De Céspedes C, Saborío M, Trejos R, el al (2003). Prevención de