Trên thế giới

Khoảng tham chiếu hiện nay là vấn đề được quan tâm của nhiều đại hội, hội thảo được tổ chức trên toàn thế giới. Sự khởi đầu của các nghiên cứu về khoảng tham chiếu bắt đầu sớm trong giai đoạn từ năm 1965 đến năm 1980. Đến nay tiến trình này kéo theo 4 phong trào và nó sẽ liên tục phát triển. Đặc biệt, xây dựng khoảng tham chiếu nhi khoa là một trong những nhiệm vụ khó khăn nhất. Cho đến nay mới có rất ít các nghiên cứu về xây dựng KTC ở trẻ sơ sinh cho xét nghiệm sàng lọc chuyển hóa bẩm sinh do

những hạn chế về việc lấy mẫu cũng như đòi hỏi số lượng mẫu rất lớn. Nổi bật là nghiên cứu của Nora Cespedes và cộng sự tiến hành ở Tây Nam Colombia tiến hành thu thập mẫu từ tháng 8 năm 2012 đến tháng 7 năm 2015 với cỡ mẫu là 891 trẻ sơ sinh khỏe mạnh từ 1 đến 18 ngày tuổi. Nghiên cứu này tiến hành xây dựng giá trị tham chiếu cho 24 thông số, trong đó có 8 thông số acid amin và 16 thông số acylcarnitine sử dụng phương pháp phổ khối đôi. Hầu hết các giá trị tham chiếu đều cho kết quả tương tự trong báo cáo di truyền. Riêng đối với C18 cho kết quả cao hơn nhiều so với các báo cáo nguyên nhân có thể do tăng âm tính giả.

1.3.2.Tại Việt Nam

Theo hiểu biết của chúng tôi hiện tại ở Việt Nam chưa có một nghiên cứu cụ thể nào về xây dựng KTC cho xét nghiệm sàng lọc chuyển hóa bẩm sinh.

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

Trẻ sơ sinh từ 24 – 72 giờ tuổi, được chỉ định xét nghiệm sàng lọc rối loạn chuyển hóa tại Bệnh viện Nhi Trung ương. Cỡ mẫu: 5675 trẻ sơ sinh khoẻ mạnh, được sàng lọc trong khoảng thời gian nghiên cứu.

 Tiêu chuẩn lựa chọn:

Trẻ khỏe mạnh, không có bất thường về chuyển hóa, không nghi ngờ có rối loạn chuyển hóa.

 Tiêu chuẩn loại trừ:

Trẻ không đáp ứng được các tiêu chuẩn lựa chọn. Các mẫu không đạt yêu cầu.

2.2. Hóa chất, thuốc thử, trang thiết bị dùng trong nghiên cứu

2.2.1. Hóa chất thuốc thử

- Hóa chất thuốc thử (chất chuẩn, thuốc thử) của hãng Labsystems Diagnostic để thực hiện các xét nghiệm

- Chất nội chuẩn acid amin, acylcarnitines - Dung dịch chiết

- Dung dịch rửa giải

2.2.2. Trang thiết bị

- Kim chích máu vô trùng có đầu dài khoảng 2 mm, giấy thấm mẫu, bông tẩm cồn sát trùng, gạc khô vô trùng, hộp đựng vật sắc nhọn màu vàng

- Máy đục lỗ giấy thấm máu khô DBS 100 - Máy lắc/ủ

- Máy sắc ký lỏng khối phổ LCMS Shimadu-8040

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện tại khoa Sinh Hóa bệnh viện Nhi Trung Ương Việt Nam từ tháng 7 năm 2018 đến tháng 12 năm 2018.

2.4. Phương pháp

2.4.1. Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang.

2.4.2. Nguyên lý kỹ thuật khối phổ kép

MSMS là thiết bị sử dụng để phân tách và định lượng các ion dựa trên tỷ số khối lượng/ điện tích của chúng. MSMS tạo ra các phần tử tích điện từ mẫu cần phân tích, sau đó sử dụng điện và từ trường để phân tách và đo lường khối lượng của các phần tử tích điện. Bộ phận phát hiện sẽ tạo ra đồ thị phổ khối của các đỉnh có thể định lượng được bằng các chuẩn nội để xác định lượng mỗi chất có mặt trong mẫu.

2.5. Nội dung nghiên cứu

2.5.1. Sơ đồ nghiên cứu

Phân phối chuẩn Phân phối không chuẩn

2.5.2. Quy trình nghiên cứu

2.5.2.1. Lấy mẫu và phân tích mẫu

- Các mẫu bệnh phẩm được thu thập và xử lý đúng cách phù hợp với thực hành thông thường đối với bệnh phẩm của bệnh nhân.

Phân tích mẫu máu của trẻ sơ sinh khỏe mạnh được chỉ định sàng lọc rối loạn chuyển hóa

Thu thập và xử lý dữ liệu Phát hiện và loại bỏ các số lạc Kiểm tra tính chuẩn Phương pháp tham số Phương pháp phi tham số Kết luận

 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu máu thấm khô được thu thập từ gót chân của trẻ sơ sinh không có bất thường về chuyển hóa. Thu thập đủ lượng máu vừa đủ các vòng tròn trên giấy thấm, để máu khô tự nhiên nơi thoáng sạch ở nhiệt độ phòng ít nhất 4 giờ, tránh ánh sáng mặt trời, và hơi nóng chiếu trực tiếp lên mẫu. Mẫu máu được chuyển về phòng xét nghiệm trong vòng 24h.

 Phân tích mẫu

Tiến hành phân tích các mẫu máu thấm khô: định lượng acid amin, acylcarnitine bằng phương pháp MS/MS

 Chuẩn bị các dung dịch nội chuẩn gốc

1. Để lọ chất nội chuẩn và dung dịch chiết về nhiệt độ phòng (18 đến 25°C)

2. Thêm vào lọ chất nội chuẩn acid amin (AA) 1 mL dung dịch chiết và lắc kỹ đến khi tan hết trong 30 phút bằng máy lắc

3. Thêm vào lọ chất nội chuẩn acylcarnitines (AC) 1 mL dung dịch chiết và lắc kỹ đến khi tan hết trong 30 phút bằng máy lắc.

 Chuẩn bị dung dịch làm việc hàng ngày: Các dung dịch làm việc hàng ngày được chuẩn bị bằng cách pha loãng các dung dịch chất nội chuẩn đã hòa tan ở trên theo tỉ lệ 1: 100 (v/v) bằng dung dịch chiết.

 Chuẩn bị mẫu: Các lọ dung dịch hóa chất, nội chuẩn được để ở nhiệt độ phòng ( 20°C đến 25°C) ít nhất 30 phút trước khi bắt đầu làm xét nghiệm.

Các bước thực hiện

1. Sử dụng máy đục lỗ DBS 100, cắt hình tròn đường kính 3 mm từ mẫu máu thấm khô của bệnh nhân vào các giếng tương ứng trên khay có đáy chữ U

2. Cắt hình tròn đường kính 3 mm của ba mẫu QC ba mức vào các giếng tương ứng trên khay có đáy chữ U, lặp lại mỗi mức QC hai giếng

3. Thêm 100 uL thuốc thử hàng ngày (chứa chất nội chuẩn) vào mỗi giếng có mẫu máu thấm khô.

4. Đậy khay bằng tấm dính và ủ trên máy lắc 20 phút với tốc độ lắc 650 vòng/ phút. Chú ý đảm bảo sau khi xong chuyển ngay sang bước tiếp theo.

5. Chuyển 70 uL dịch chiết từ mỗi giếng chữ U sang giếng tương ứng của khay

đáy chữ V. Đậy khay bằng tấm nhôm để tránh bay hơi.

6. Đưa khay đã được đậy tấm nhôm vào bộ phận bơm mẫu tự động máy

LCMSMS 8040

7. Lựa chọn các mẫu cần chạy và ấn nút để chạy các mẫu. Đảm bảo bơm dung môi đã được bật trước khi chạy. 2.5.2.3. Thu thập và xử lý dữ liệu

- Các giá trị tham chiếu đã được kiểm tra và phân tích trên SPSS 20, tất cả các thử nghiệm thống kê được cho là có ý nghĩa với p < 0,05 (hai mặt)

- Các số lạc được phát hiện dựa trên phương pháp Tukey và sau đó loại bỏ các giá trị này

- Đánh giá phân phối dữ liệu dựa trên các kiểm tra biểu đồ và quy tắc. Số lượng đối tượng là hơn 50 vì vậy có thể sử dụng thử nghiệm Kolmogorov- Smirnov để kiểm tra tính chuẩn. Ở giá trị p>0.05 phân phối dữ liệu tuân theo phân phối xác suất chuẩn và các trường hợp khác thì không. Từ đó giá trị trung bình X và độ lệch chuẩn SD đã được tính toán.

2.5.4. Kết luận và lập hồ sơ

Cuối cùng, tất cả các bước và quy trình được đề cập trước đó được ghi lại.

2.3. Đạo đức nghiên cứu

- Bệnh nhân tham gia hoàn toàn tự nguyện trong nghiên cứu này và thông tin của họ được bảo mật

- Mục đích chính của nghiên cứu này là để xây dựng giá trị tham chiếu phù hợp sử dụng cho phòng xét nghiệm, không vì mục đích nào khác.

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ

Tổng cộng 5675 trẻ sơ sinh khỏe mạnh không mắc các rối loạn chuyển hóa đã tham gia vào nghiên cứu này để xác định khoảng tham chiếu cho 42 thông số chuyển hóa ở trẻ sơ sinh. Phân tích ban đầu về dữ liệu thô bao gồm nhận dạng và xử lý các số lạc cũng như kiểm tra tính chuẩn được thực hiện bởi SPSS 20. Theo hướng dẫn của CLSI số C28-A3c, nếu là phân phối chuẩn thì sẽ áp dụng phương pháp tham số và nếu phân phối không chuẩn thì áp dụng phương pháp phi tham số.

3.1. Kết quả khoảng tham chiếu của các acid amin

3.1.1.Kết quả xây dựng khoảng tham chiếu của xét nghiệm Alanin

Nhận xét: Hình dạng tổng thể của phân phối này lệch sang phải. Sau khi đã loại bỏ các ngoại lệ, n = 5481 nên kiểm nghiệm Kolmogorov-Smirnov được sử dụng để kiểm tra tính chuẩn của dữ liệu.

Bảng 3.1: Kiểm nghiệm tính chuẩn của Alanin

Kolmogorov-Smirnov

Thống kê Df P

0.071 5481 0.000

Nhận xét: Bảng 3.1 cho thấy các giá trị không tuân theo phân phối xác suất chuẩn (p<0.05) nên phương pháp phi tham số được áp dụng. Tất cả các giá trị được sắp xếp theo thứ tự tăng dần và x đại diện cho thứ hạng của một giá trị (nhỏ nhất x=1). Khoảng tham chiếu với giới hạn dưới x2,5 và giới hạn trên x97,5

được tính tương ứng với 0.025 (n + 1) và 0.975 (n +1): X2,5 = 0.025 * 5482 = 137.05  137

X97,5 = 0.975 * 5482 = 5344.95  5345

Hình 3.2: Giá trị - tần số của Ala.

Nhận xét: Hình 3.2 giúp xác định giới hạn trên và dưới của nồng độ Alanin ở trẻ sơ sinh. Như vậy, khoảng tham chiếu được lấy từ 90.06 umol/l đến 314.44 umol/l.

Theo cách tương tự các thông số acid amin còn lại được tính toán và thể hiện trong bảng dưới đây. Dữ liệu của các thông số đều không tuân theo phân phối chuẩn.

Bảng 3.2: Kết quả khoảng tham chiếu của các acid amin.

Các chỉ số N Trung bình (umol/l) SD ^Tối

thiểu ^{Tối đa 95% CI (umol/l)}

Khoảng tham chiếu (umol/l) Ala 5481 181.87 58.14 39.26 341.01 180.33 - 183.41 90.06 - 314.44 Arg 5014 3.66 1.48 0 7.69 3.62 - 3.7 1.54 - 7.12 Asp 5267 33.298 16.15 0 75.93 32.86 - 33.73 3.64 - 68.94 Cit 5516 8.85 2.65 1.53 16.13 8.78 - 8.92 4.3 - 14.52 Glu 5566 506 133.78 133 879.47 502.48 - 509.52 280.59 - 779.51 Gly 5382 214.76 67.89 54.6 387.35 212.95 - 216.58 94.39 - 360.22 Leu 5508 98.81 26.29 30.45 169.34 98.11 - 99.5 54.61 - 155.57 Lys 5556 157.99 48.61 39 295.71 156.71 - 159.27 87.51 - 269.35 Met 5559 17.66 5.118 3.51 31.85 17.52 - 17.79 8.73 - 28.63 Orn 5570 34.91 12.49 0 69.52 34.58 - 35.24 13.62 - 59.83 Phe 5624 45.76 10.74 15.82 76.24 45.48 - 46.04 27.82 - 68.82 Pro 5445 108 27.12 37.68 181.35 107.28 - 108.72 59.47 - 167.49 Ser 5646 177.36 52.76 30.1 335.85 175.99 - 178.74 73.86 – 250 Tyr 5493 43.34 20.08 0 99.94 42.81 - 43.87 14.06 - 88.91 Val 5502 79.29 19.74 23.59 134.74 78.77 - 79.81 46.47 - 123.8

Nhận xét: Các acid amin có nồng độ nằm trong khoảng 3.66 – 506 umol/l. Trong đó Glu (506 umol/l), Gly (214,76 umol/l), Ala (181,87 umol/l) là các acid amin có nồng độ cao nhất và Arg (3.66 umol/l), Cit (8.85 umol/l) là các acid amin có nồng độ thấp nhất.

3.2. Kết quả khoảng tham chiếu của acylcarnitine

3.2.1.Kết quả xây dựng khoảng tham chiếu của thông số C14

Hình 3.3: Sự phân bố mức độ C14

Nhận xét: Hình dạng tổng thể của phân phối này lệch sang phải. Sau khi đã loại bỏ các ngoại lệ, n = 5550 nên kiểm nghiệm Kolmogorov-Smirnov được sử dụng để kiểm tra tính chuẩn của dữ liệu.

Bảng 3.3: Kiểm nghiệm tính chuẩn của C14

Kolmogorov-Smirnova

Statistic Df Sig.

C14 0.087 5550 0.000

Nhận xét: Bảng 3.3 cho thấy các giá trị không tuân theo phân phối xác suất chuẩn (p<0.05) nên phương pháp phi tham số được áp dụng. Tất cả các giá trị được sắp xếp theo thứ tự tăng dần và x đại diện cho thứ hạng của một giá trị

(nhỏ nhất x=1). Khoảng tham chiếu với giới hạn dưới x2,5 và giới hạn trên x97,5

được tính tương ứng với 0.025 (n + 1) và 0.975 (n +1): X2,5 = 0.025 * 5551 = 138.78  139 X97,5 = 0.975 * 5482 = 5412.22 5412 Bảng 3.4: Giá trị - tần số của C14 Giá trị Tần số _{Giá trị Tần số} 0.03 4 0.15 422 0.04 10 0.16 371 0.05 16 0.17 315 0.06 42 0.18 255 0.07 255 0.19 224 0.08 248 0.2 175 0.09 343 0.21 135 0.1 452 0.22 110 0.11 456 0.23 96 0.12 497 0.24 52 0.13 499 0.25 56 0.14 480 0.26 37

Nhận xét: Bảng 3.4 giúp xác định giới hạn trên và dưới của nồng độ C14 ở trẻ sơ sinh. Như vậy, khoảng tham chiếu được lấy từ 0.07 umol/l đến 0.24 umol/l. Theo cách tương tự các thông số acylcarnitine còn lại được tính toán và thể hiện trong bảng dưới đây. Dữ liệu của các thông số đều không tuân theo phân phối chuẩn.

Giá trị ở vị trí 139

Giá trị ở vị trí 5412

Bảng 3.5: Kết quả khoảng tham chiếu của các acylcarnitine.

Các chỉ số N ^{Trung bình}_(umol/l) SD Tối thiểu Tối đa 95% CI (umol/l) _{tham chiếu (umol/l)}^Khoảng C0 5458 20.05 5.76 6.19 35.82 19.9 - 20.21 11.18 - 33.09 C2 5490 18.34 5.587 3.89 33.47 18.19 - 18.49 7.34 - 30.67 C3 5394 1.53 0.518 0.22 2.94 1.51 - 1.54 0.65 - 2.68 C4 5509 0.14 0.047 0 0.27 0.138 - 0.14 0.07 - 0.25 C4OH 5474 0.069 0.0335 0 0.16 0.069 - 0.0704 0.02 - 0.15 C5 5449 0.094 0.042 0 0.21 0.092 - 0.095 0.03 - 0.19 C5:1 5670 0.039 0.023 0 0.09 0.0379 - 0.039 0.01 - 0.08 C5OH 5327 0.119 0.048 0 0.24 0.118 - 0.121 0.045 - 0.23 C5DC 5669 0.14 0.071 0 0.37 0.138 - 0.142 0.02 - 0.25 C6 5610 0.037 0.015 0 0.08 0.0369 - 0.038 0.01 - 0.07 C6DC 5455 0.116 0.0497 0 0.25 0.114 - 0.117 0.02 - 0.21 C8 5358 0.033 0.012 0 0.06 0.0325 - 0.033 0.02 - 0.06 C8:1 5570 0.044 0.021 0 0.1 0.0439 - 0.045 0.01 - 0.09 C10 5461 0.041 0.0168 0 0.08 0.0401 - 0.041 0.01 - 0.08 C10:1 5537 0.031 0.0131 0 0.06 0.0302 - 0.031 0.01 - 0.06 C10:2 5663 0.027 0.0189 0 0.08 0.0266 - 0.027 0.01 - 0.08 C12 5511 0.057 0.02 0.01 0.11 0.0568- 0.0579 0.02 - 0.1 C12:1 5438 0.022 0.011 0 0.05 0.0215 - 0.022 0.01 - 0.05 C14 5550 0.139 0.044 0.03 0.26 0.1376- 0.1399 0.07 - 0.24 C14:1 5572 0.074 0.034 0.01 0.17 0.0736- 0.0754 0.02 - 0.15 C14:2 5483 0.016 0.0067 0 0.03 0.0155- 0.0159 0.01 - 0.03 C14OH 5599 0.007 0.0059 0 0.02 0.0067 - 0.007 0 - 0.02 C16 5461 1.98 0.699 0 3.89 1.957 - 1.994 0.85 - 3.48 C16:1 5502 0.135 0.0495 0.02 0.27 0.1334 - 0.136 0.06 - 0.25 C16:1OH 5353 0.024 0.0087 0.01 0.04 0.0238- 0.0243 0.01 - 0.04 C16:OH 4910 0.01 0.003 0 0.03 0 - 0.01 0 - 0.01 C18 5515 0.611 0.198 0.18 1.16 0.606 - 0.616 0.31 - 1.05 C18:1 5524 0.92 0.283 0.11 1.7 0.908 - 0.923 0.47 - 1.55 C18:1OH 4476 0.01 0.002 0 0,02 0 - 0.01 0 - 0.01 C18:2 5431 0.125 0.052 0 0.26 0.1235 - 0.126 0.04 - 0.24 C18OH 4325 0.01 0.001 0 0.02 0 - 0.01 0 - 0.01

Nhận xét: Nhìn chung, các acylcarnitine chuỗi ngắn có nồng độ cao hơn chuỗi dài. Quan sát thấy C0 (20.05 umol/l), C2 (18.35 umol/l) là các acylcarnitine có nồng độ cao nhất trong khi C14OH (0.007 umol/l) có nồng độ thấp nhất. C16 (1.98 umol/l) có nồng độ cao nhất trong số các acylcarnitine chuỗi dài

CHƯƠNG 4

BÀN LUẬN

Giá trị của khoảng tham chiếu là một trong những yếu tố quan trọng nhất để giải thích các xét nghiệm lâm sàng vì khoảng tham chiếu đóng vai trò là điểm chuẩn để so sánh kết quả xét nghiệm của bệnh nhân. Trong mọi trường hợp, khoảng tham chiếu của người lớn không nên được áp dụng cho trẻ em do sự khác biệt lớn về các đặc điểm sinh lý. Sinh lý của trẻ em liên tục phát triển và thay đổi giữa các cá thể. Hiện nay, rối loạn chuyển hóa bẩm sinh là một vấn đề đáng lo ngại và rất cần được quan tâm ở trẻ em. Lỗi bẩm sinh về chuyển hóa đại diện cho một vấn đề sức khỏe cộng đồng quan trọng do những hạn chế về chẩn đoán và điều trị hiện tại, chất lượng cuộc sống của