3.3.2.1. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký
Dựa trên một số tài liệu tham khảo (Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, DĐVN IV, phụ lục 5.3) [6] và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, khảo sát về thành phần pha động, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, chúng tôi xây dựng được chương trình sắc ký sử dụng hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity như sau:
Pha tĩnh: cột Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 mm i.d. x 250 mm L; 5 μm);
Pha động: Acid formic 0,2%/Nước (A): acetonitril (B) theo chương trình gradient trong 30 phút (Bảng 3.2).
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/min Thể tích tiêm mẫu: 5 μl
- Detecter DAD với bước sóng phát hiện: 270 nm - Dung môi pha mẫu: methanol
- Nồng độ tiêm sắc kí khoảng 0,5 mg/ml
- Mẫu: Cân khoảng 2 mg tanshinon IIA tinh chế được vào cốc có mỏ, sau đó thêm 4 ml methanol. Dùng máy siêu âm để hòa tan tanshinon IIA trong methanol. Lọc qua màng lọc 0,45
µm.
Bảng 3.2. Chương trình gradient trong 30 phút Thời gian (phút) 0-5 5-15 15-20 20-25 25-30 3.3.2.2. Đánh giá tính thích hợp của hệ thống
Trước khi tiến hành sắc ký định lượng tanshinon IIA tinh chế được, chúng tôi tiến hành xác định tính thích hợp của hệ thống sắc ký.
Tiêm 6 lần dung dịch được mẫu chuẩn bị ở trên vào hệ thống HPLC và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn ở trên. Ghi kết quả về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký để định lượng
tanshinon IIA tinh chế được
TT 1 2 3 4 5 6 TB RSD (%)
Nhận xét:
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic trong các phép thử lần lượt là 0,20 và 0,21 đều nhỏ hơn 2%, số đĩa lý thuyết trung bình là 59323 thể hiện khả năng tách tốt của cột sắc ký. Như vậy chứng tỏ rằng hệ thống HPLC được sử dụng là thích hợp để định tính, định lượng tanshinon IIA tinh chế được.
3.3.2.3. Xác định độ tinh khiết và tạp chất
Sử dụng phương pháp tổng diện tích pic tính toán độ tinh khiết của mẫu phân tích. Tiến hành sắc ký 3 lần theo chương trình ở mục 3.3.2.1, phân tích các pic phụ (tạp chất) trên sắc ký đồ (Hình 3.6).
Tính tổng diện tích của tất cả các pic phụ thu được trên sắc kí đồ của dung dịch mẫu, không kể các pic phụ có diện tích pic nhỏ hơn 0,025 lần diện tích của pic chính thu được trên sắc kí đồ của dung dịch thử. So sánh tổng giá trị diện tích của các pic phụ này với diện tích pic của dung dịch mẫu, từ đó kết luận về giới hạn tổng cộng tạp chất liên quan của tanshinon IIA tinh chế được. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả phân tích độ tinh khiết của tanshinon IIA tinh chế
STT
1
2
3
Nhận xét: Kết quả thực nghiệm cho thấy tanshinon IIA tinh chế được có độ tinh khiết cao (>95%) Các pic phụ (tạp chất) đều tách rõ ràng khỏi pic chất. Sản phẩm tanshinon IIA tinh chế được trong nghiên cứu này có giới hạn tổng cộng các
tạp chất liên quan không quá 5,0 % phù hợp làm chất chuẩn phân tích, chất chuẩn đối chiếu.
Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC của tanshinon IIA
Thiết lập chất chuẩn tanshinon IIA đã tinh chế làm chất chuẩn đối chiếu:
-Cảm quan: Bột màu cam
-Nhiệt độ nóng chảy: 202 – 204oC
-Phổ khối lượng ESI-MS với sự xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 295, M=294 trùng
khớp với công thức phân tử C19H18O3 trong dữ liệu đã công bố [21-22].
-Phổ 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) cho thấy các tín hiệu ( H, ppm): ): δ 7,63 (1H, d,
J = 8,0 Hz, H-6), 7,56 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-7), 7,23 (1H, d, J = 1,2 Hz, H-16), 3,19 (2H, t, J = 6,4 Hz, H-1), 2,27 (3H, d, J = 1,2 Hz, H3-17), 1,79 (2H, m, H-2), 1,66 (2H, m, H-3), 1,31 (6H, s, H3-18,19).
19,2 (C-2), 37,9 (C-3), 34,7 (C-4), 150,2 (C-5), 133,5 (C-6), 120,3 (C-7), 127,5 (C-8), 126,5 (C-9), 144,5 (C-10), 183,7 (C-11), 175,8 (C-12), 121,2 (C-13), 161,8 (C-14), 141,3 (C-15), 120,3 (C-16), 8,8 (C-17), 31,8 (C-18), 31,8 (C-19).
-Độ tinh khiết: 96,57% (>95%) -Tạp chất liên quan: 3,43% (<5%)
Nhận xét: Hợp chất tanshinon IIA tinh chế bước đầu đáp ứng yêu cầu làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm và nghiên cứu.
