Hợp chất A được phân lập từ phân đoạn hữu cơ ít phân cực hexan, phân đoạn giàu tanshinon. Hợp chất được xác định cấu trúc bằng phương pháp đo phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Dữ liệu phổ thu được như sau:
- Phổ khối lượng ESI-MS: m/z 295 [M + H]+; - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Bảng 3.1).
PPM
200
(A) Phổ 1H-NMR
(B) Phổ 13C-NMR
Hình 3.3. Phổ1H-NMR (CDCl3,400MHz) và13C-NMR (CDCl3,100MHz) của
tanshinon IIA phân lập được
Bảng 3.1. Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR của tanshinon IIA Vị trí 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 3.2.3. Xác định cấu trúc
Hợp chất thu được dưới dạng bột màu cam và là chất chính của mẫu đan sâm qua phân tích TLC. Dữ liệu phổ NMR của các tín hiệu vòng furan (vòng D) với sự xuất
Điều này được minh chứng thêm bằng phổ khối ESI-MS với sự xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 295 phù hợp với sự công thức phân tử C19H18O3 (M = 294). Căn cứ vào các phân tích nêu trên cùng với sự phù hợp phổ NMR của tanshinon IIA trong tài liệu tham khảo [21-22] giúp khẳng định chính xác chất này là tanshinon IIA (Hình 3.4).
Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của tanshinon
IIA 3.2.4. Đánh giá sơ bộ độ tinh khiết
Trên sắc ký lớp mỏng pha đảo C18, hệ pha động MeOH-H2O (10:1, v/v) kết quả thu được là một vệt tròn, gọn rõ nét với Rf = 0,33; không có các vệt phụ, chứng tỏ tanshinon IIA thu được có độ tinh khiết cao
Hình 3.5. Sắc ký lớp mỏng khảo sát tanshinon IIA tinh chế được
Kết hợp với phổ cộng hưởng từ cho thấy mẫu tanshinon IIA tinh chế được đạt độ tinh khiết cao.
3.3. Thiết lập chất chuẩn đối chiếu
3.3.1. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng của tanshinon IIA
3.3.1.1. Đặc điểm cảm quan
Đặc điểm cảm quan của đối tượng nghiên cứu quan sát bằng mắt thường dưới ánh sáng ban ngày. Tanshinon IIA sau tinh chế là chất bột màu cam.
3.3.1.2. Điểm chảy
Tiến hành đo điểm chảy của hợp chất nghiên cứu theo DĐVN IV (PL-150, Phương pháp 1 – phương pháp đo trong mao quản). Đưa một lượng tanshinon IIA tinh chế đã được nghiền mịn vào ống mao quản thuỷ tinh và xác định điểm chảy bằng máy đo điểm chảy. Tanshinon IIA tinh chế được có nhiệt độ nóng chảy là 202- 204oC.
3.3.1.3. Dữ liệu phổ
Dữ liệu phổ nhận dạng tanshinon IIA bao gồm phổ khối lượng (ESI-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).
Như trong phần biện luận và xác định cấu trúc hóa học của tanshinon IIA, các dữ liệu phổ của hợp chất này phù hợp với dữ liệu công bố của tanshinon IIA trong tài liệu tham khảo.
3.3.1.4. Tinh chế tanshinon IIA phân lập được
Hợp chất tanshinon IIA được tinh chế thêm để khảo sát làm chất chuẩn đối chiếu phòng thí nghiệm b ằng phương pháp kết tinh lại trong dung môi MeOH thu được tanshinon IIA tinh ch ế dạng bột mịn màu cam (400 mg).
3.3.2. Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất
3.3.2.1. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký
Dựa trên một số tài liệu tham khảo (Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, DĐVN IV, phụ lục 5.3) [6] và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, khảo sát về thành phần pha động, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, chúng tôi xây dựng được chương trình sắc ký sử dụng hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity như sau:
Pha tĩnh: cột Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 mm i.d. x 250 mm L; 5 μm); (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Pha động: Acid formic 0,2%/Nước (A): acetonitril (B) theo chương trình gradient trong 30 phút (Bảng 3.2).
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/min Thể tích tiêm mẫu: 5 μl
- Detecter DAD với bước sóng phát hiện: 270 nm - Dung môi pha mẫu: methanol
- Nồng độ tiêm sắc kí khoảng 0,5 mg/ml
- Mẫu: Cân khoảng 2 mg tanshinon IIA tinh chế được vào cốc có mỏ, sau đó thêm 4 ml methanol. Dùng máy siêu âm để hòa tan tanshinon IIA trong methanol. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Bảng 3.2. Chương trình gradient trong 30 phút Thời gian (phút) 0-5 5-15 15-20 20-25 25-30 3.3.2.2. Đánh giá tính thích hợp của hệ thống
Trước khi tiến hành sắc ký định lượng tanshinon IIA tinh chế được, chúng tôi tiến hành xác định tính thích hợp của hệ thống sắc ký.
Tiêm 6 lần dung dịch được mẫu chuẩn bị ở trên vào hệ thống HPLC và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn ở trên. Ghi kết quả về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký để định lượng
tanshinon IIA tinh chế được
TT 1 2 3 4 5 6 TB RSD (%)
Nhận xét:
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic trong các phép thử lần lượt là 0,20 và 0,21 đều nhỏ hơn 2%, số đĩa lý thuyết trung bình là 59323 thể hiện khả năng tách tốt của cột sắc ký. Như vậy chứng tỏ rằng hệ thống HPLC được sử dụng là thích hợp để định tính, định lượng tanshinon IIA tinh chế được.
3.3.2.3. Xác định độ tinh khiết và tạp chất
Sử dụng phương pháp tổng diện tích pic tính toán độ tinh khiết của mẫu phân tích. Tiến hành sắc ký 3 lần theo chương trình ở mục 3.3.2.1, phân tích các pic phụ (tạp chất) trên sắc ký đồ (Hình 3.6).
Tính tổng diện tích của tất cả các pic phụ thu được trên sắc kí đồ của dung dịch mẫu, không kể các pic phụ có diện tích pic nhỏ hơn 0,025 lần diện tích của pic chính thu được trên sắc kí đồ của dung dịch thử. So sánh tổng giá trị diện tích của các pic phụ này với diện tích pic của dung dịch mẫu, từ đó kết luận về giới hạn tổng cộng tạp chất liên quan của tanshinon IIA tinh chế được. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả phân tích độ tinh khiết của tanshinon IIA tinh chế
STT
1
2
3
Nhận xét: Kết quả thực nghiệm cho thấy tanshinon IIA tinh chế được có độ tinh khiết cao (>95%) Các pic phụ (tạp chất) đều tách rõ ràng khỏi pic chất. Sản phẩm tanshinon IIA tinh chế được trong nghiên cứu này có giới hạn tổng cộng các
tạp chất liên quan không quá 5,0 % phù hợp làm chất chuẩn phân tích, chất chuẩn đối chiếu.
Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC của tanshinon IIA
Thiết lập chất chuẩn tanshinon IIA đã tinh chế làm chất chuẩn đối chiếu:
-Cảm quan: Bột màu cam
-Nhiệt độ nóng chảy: 202 – 204oC
-Phổ khối lượng ESI-MS với sự xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 295, M=294 trùng khớp với công thức phân tử C19H18O3 trong dữ liệu đã công bố [21-22].
-Phổ 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) cho thấy các tín hiệu ( H, ppm): ): δ 7,63 (1H, d,
J = 8,0 Hz, H-6), 7,56 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-7), 7,23 (1H, d, J = 1,2 Hz, H-16), 3,19 (2H, t, J = 6,4 Hz, H-1), 2,27 (3H, d, J = 1,2 Hz, H3-17), 1,79 (2H, m, H-2), 1,66 (2H, m, H-3), 1,31 (6H, s, H3-18,19). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
19,2 (C-2), 37,9 (C-3), 34,7 (C-4), 150,2 (C-5), 133,5 (C-6), 120,3 (C-7), 127,5 (C-8), 126,5 (C-9), 144,5 (C-10), 183,7 (C-11), 175,8 (C-12), 121,2 (C-13), 161,8 (C-14), 141,3 (C-15), 120,3 (C-16), 8,8 (C-17), 31,8 (C-18), 31,8 (C-19).
-Độ tinh khiết: 96,57% (>95%) -Tạp chất liên quan: 3,43% (<5%)
Nhận xét: Hợp chất tanshinon IIA tinh chế bước đầu đáp ứng yêu cầu làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm và nghiên cứu.
3.4. Bàn luận
3.4.1. Về phân lập và xác định cấu trúc của tanshinon IIA
Tanshinon IIA là thành phần hoạt chất chính của đan sâm và trên cơ sở tham khảo các tài liệu và thực nghiệm, chúng tôi đã xây dựng được quá trình phân lập tanshinon IIA như Hình 3.1 với các bước chiết xuất và phân lập sắc ký.
Tanshinon IIA thu được được nhận dạng trên cơ sở đặc điểm vật lý (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy), phương pháp phổ khối và phổ cộng hưởng từ (1H và 13C NMR) và so sánh tương quan với dữ liệu trong tài liệu tham khảo về điểm chảy, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, khẳng định công thức phân tử và cấu trúc hóa học của tanshinon IIA tinh chế được. Ngoài ra các kết quả này cũng góp phần dánh giá tanshinon IIA tinh chế được có độ tinh khiết cao. Đó là cơ sở cho bộ dữ liệu nhận dạng trong thiết lập chất chuẩn đối chiếu của tanshinon IIA.
3.4.2. Về phân tích HPLC
Tanshinon IIA thu được có độ tinh khiết cao trên cơ sở khảo sát TLC và đặc biệt là sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC. Phương pháp HPLC với detecter DAD được xây dựng dùng để xác định giới hạn tạp chất liên quan và có thể dùng để định tính, định lượng tanshinon IIA tinh chế. Kết quả xác định giới hạn tạp chất liên quan cho thấy sản phẩm tanshinon IIA tinh chế có giới hạn tổng cộng các tạp chất liên quan không quá 5,0 % đáp ứng tiêu chuẩn làm chất chuẩn đối chiếu.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Sau quá trình nghiên cứu chúng tôi đã hoàn thành các mục tiêu của khóa luận tốt nghiệp với các kết quả thu được như sau:
- Đã chiết xuất và phân lập được tanshinon IIA từ đan sâm.
- Tinh chế để làm tăng độ tinh khiết của tanshinon IIA phân lập được để thiết lập chất chuẩn, chất đối chiếu.
- Xác định được cấu trúc tanshinon IIA sử dụng các phương pháp phổ. Dữ liệu nhận dạng của tanshinon IIA bao gồm đặc điểm vật lý, dữ liệu phổ khối và phổ cộng hưởng từ.
- Bước đầu thiết lập được tanshinon IIA làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm dược liệu với những tiêu chuẩn chất lượng về:
+ Độ tinh khiết: 96,57% (>95%)
+ Tạp chất liên quan: 3,43% (<5%)
Các kết quả thu được làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo của bao gồm: - Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng tanshinon IIA tinh chế được bằng HPLC: Đánh giá các chỉ tiêu bao gồm: Tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng, LOD, LOQ.
- Tiếp tục nghiên cứu để xác định cụ thể các tạp chất và cách để loại tối đa các tạp đó để tăng độ tinh khiết cho tanshinon IIA làm chất chuẩn đối chiếu.
- Đánh giá chất chuẩn thông qua 3 phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP/ISO.
- Nghiên cứu độ ổn định của chất chuẩn đối chiếu trong điều kiện bảo quản 2-8oC.
- Ứng dụng các chất chuẩn đối chiếu thiết lập được để đánh giá chất lượng một số dược liệu và chế phẩm đông dược.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương và cs (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I, Nxb. Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr. 732- 738.
2. Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, Nxb. Y học, Hà Nội, tr. 390- 400.
3. Bộ Y tế, Vụ khoa học và đào tạo (2006), Dược học cổ truyền, Nxb. Y học, Hà Nội, tr. 231-232.
4. Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr. 107–113, tr. 216-250.
5. Bộ Y tế, Vụ khoa học và đào tạo (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, tr. 79-82, 84-110.
6. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nxb. Y học, Hà Nội, tr. 751-752, PL 129, PL 131, PL 239, PL 5.3.
7. Bộ Y tế (2011), Dược liệu học I, Nxb. Y học, Hà Nội, tr. 255-256. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
8. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học, tr. 8-99, 162-196, 234-242.
9. Đỗ Thị Hà, Lê Thị Loan, Nguyễn Minh Khởi, Trần Thị Hồng Phương (2016). Xây dựng phương pháp định lượng tanshinon IIA trong dược liệu đan sâm trồng ở Việt Nam bằng HPLC-DAD. Tạp chí Dược liệu 21, 50-54.
10. Nguyễn Thị Minh Hằng (2001), Nghiên cứu tác dụng chống đông máu và hạ lipid máu của đan sâm và bài thuốc sinh hóa thang, Đại học Dược Hà Nội.
11. Nguyễn Thị Thu Hòa (2012), Nghiên cứu tiêu chuẩn cao đặc hỗn hợp hoàng kỳ và đan sâm, Luận văn thạc sĩ dược học, Đại học Dược Hà Nội.
12. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, tập II, Nxb. Trẻ, tr. 865-866.
13. Vũ Thị Thăng Long (2007), Nghiên cứu định lượng Tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Khoá luận tốt nghiệpdược sĩ đại học.
14. Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb. Y học, Hà Nội, tr. 818-820.
15. Ngô Quốc Luật, Trần Danh Việt, Đào Văn Núi (2014). Nghiên cứu di thực cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) tại Việt Nam. Tạp chí Dược học 54 (4), 687-691.
16. Ngô Quốc Luật, Trần Danh Việt, Lê Tiến Vinh, Phương Thiện Thương (2014). Đánh giá chất lượng dược liệu đan sâm di thực trồng tại Việt Nam. Tạp chí Dược học 455, 47-51.
17. Thái Phan Quỳnh Như (2001), Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năngcao (HPLC), Viện kiểm nghiệm Bộ y tế.
18. Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Nhà xuất bảnkhoa học và kỹ thuật tr. 199 – 222; 493 – 685.
19. Trường Đại học Dược Hà nội, Bộ môn hoá phân tích (2006), Hoá phân tích II, tr. 17, 99-146, 173-222.
20. Hoàng Duy Tân, Trần Văn Nhủ (2001), Từ điển phương thang đông y, Nhà xuất bản Đồng Nai.
21. Phương Thiện Thương, Nguyễn Thị Kim An, Nguyễn Minh Khởi, Fumiaki Ito (2013). Các tanshinon phân lập từ rễ cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) di thực và trồng ở Việt Nam. Tạp chí Dược học 53 (1), 44-47.
22. Nguyễn Hữu Tùng, Nguyễn Thanh Hải, Vũ Đức Lợi, Bùi Thanh Tùng, Nguyễn Tiến Vững, Bùi Hồng Cường (2016). Một số hợp chất phân lập từ rễ cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) trồng ở huyện Bắc Hà, tỉnh Lào Cai. Tạp chí Dược học 56 (4), 43-47.
23. Nguyễn Hữu Tùng, Vũ Đức Lợi, Bùi Thanh Tùng, Lê Quốc Hùng, Dương Thị Ly Hương, Nguyễn Thanh Hải (2016). Thành phần triterpene năm vòng khung ursane phân lập từ rễ cây Đan sâm trồng ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoahọc Y Dược 32 (2), 33-36.
24. Vũ Phương Xuân (2000), Thực vật chí Việt Nam, tập II, Nxb. Khoa học và kỹ thuật, tr. 115-126.
25. Đỗ Thị Xuyến, Vũ Xuân Phương (2013), “Bổ sung loài Salvia japonica Thunberg (họ BẠc Hà- Lamiaceae) cho hệ thực vật Việt Nam”, Tạp chí sinhhọc (35), tr. 41- 44.
TIẾNG ANH
26. Wang BQ (2010). Salvia miltiorrhiza: Chemical and pharmacological review of a medicinal plant. Journal of Medicinal Plants Research 4 (25), 2813-2820.
27. Dai Hui, Xiao Chaoni, Liu Hongbing, Tang Huiru (2009), “Comnined NMR and LC- MS Analysis Reveals the Metanonomic Changes in Salvia miltiorrhiza Bunge Induced by Water Depletion”, Journal of Proteome Research, 9(3), pp. 1460-1475.
28. Li Min Hui, Li Qian Quan, Liu Yan Ze, Cui Zhan Hu, Zhang Na, Huang Lu Qi, Xiao Pei Gen (2013), “Pharmacophylogenetic Study on Plants of Genus Salvia
L. from China”, Chinese Herbal Medicines, 5(3), pp. 164-181.
29. Zhou L, Zuo Z, Chow MS (2005). Dansen: An overview of its chemistry, pharmacology, pharmacokinetics, and clinical use. The Journal of Clinical Pharmacology 45 (12), 1345-1359.
30. Chase Mark W.(2009), “An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG III”, Botanical Journal of the Linnean Society, 161, pp. 105-121.
31. Kintzios Spiridon E (2003), Sage: the genus Salvia, CRC Press, pp. 9-18, 55- 66,143-174.
32. Nicolin Vanessa, Fancellu Giovanni, Valentini Roberto (2014), “Effect of tanshinone II on cell growth of breast cancer cell line type MCF-7 and MD- MB- 231”, IJAE, 119(1), pp. 38-43.
33. Xu Yan Yan, Wan Ren Zhong, Lin Yan Ping, Yang Ling, Chen Yong, Liu Chang Xiao (2007), “Recent advance on research and atrlication of Salvia miltiorrhiza”,
Asian Journal of Pharmacodynamics and Pharmacokinetics, 7(2), pp. 99-130. 34. Ikeshiro Yasumasa, Mase Izumi, Tomita Yutaka (1989), “Abietane type diterpenoids
from Salvia miltiorrhiza”, Phytochemistry, 28(11), pp. 3139-3141. (8) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
35. Lu Yinrong, Yeap Foo L. (2002), “Polyphenolics of Salvia—a review”,
Phytochemistry, 59(2), pp. 117-140.
36. Xu YY et al. (2007). Recent advance on research and atrlication of Salvia miltiorrhiza.
PHỤ LỤC
Phụ lục 01 Phổ ESI-MS của tanshinon IIA
Phụ lục 02 Một số hình ảnh sắc ký lớp mỏng của tanshinon IIA Phụ lục 03 Khảo sát điều kiện sắc kí Phụ lục 04 Độ thích hợp hệ
thống
Phụ lục 02.Một số hình ảnh sắc ký lớp mỏng của tanshinon IIA