HPLC
4.3.1. Xây dựng phương pháp
Chúng tôi thực hiện xây dựng phương pháp HPLC với detector DAD để định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế đượ c. Đề tài sử dụng phương pháp phân tích định lượng saponin bằng HPLC là phương pháp được Dược điển các nước công nhận đạt yêu cầu về tính tiên tiến so với phương pháp quang phổ hay phương pháp khối lượng của phần lớn các chuyên luận dược liệu hiện nay. Đây là phương pháp có nhiều ưu điểm như có thể tiến hành đơn giản từ việc pha mẫu, chuẩn bị dung môi pha động đến tiến hành s ắ c ký. Trong khoảng nồng độ khảo sát, giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ. Phương pháp còn đảm bảo độ đúng và độ đặc hiệu cao.
Tham khảo một số tài liệu kết hợp với các điều kiện có sẵn, chúng tôi đã lựa chọn được chương trình sắc ký như mô tả ở mục 3.3.1. Với điều kiện sắc ký đã lựa chọn, chất nghiên cứu trong mẫu thử chuẩn bị từ dịch chiết n-butanol thân rễ SVD và chất phân l ậ p được tách tương đối tốt, pic cân đối, thời gian lưu hợp lý, phù hợp để định lượng thành phần trong thân rễ SVD.
4.3.2. Phân tích định tính và định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được 4.3.2.1. Định tính
Kết quả trên SKĐ chạy HPLC của 3 mẫu: stipuleanosid R2 phân lập được, cao BuOH và chất chuẩn đối chiếu đều cho pic ở thời gian lưu ở khoảng phút thứ
15. Theo các tài liệu nghiên cứu cho đến hiện nay, có thể khẳng định thời gian lưu đó là của hợp chất stipuleanosid R2.
Bằng phương pháp HPLC với detector UV đã xây dựng để định tính, định lượng stipuleanosid R2 và xác định giới hạn tạp chất liên quan của stipuleanosid R2 tinh chế được, chúng tôi đã xác định được chính xác hàm lượng stipuleanosid R2 tinh chế được là 96,22 0,11 (%) > 95,0% (tính theo nguyên trạng), đạt yêu cầu để thiết lập chất chuẩn đối chiếu.
Stipuleanosid R2 được tinh chế và xây dựng thành chất đối chi ếu sử dụng trong phân tích, xây dựng tiêu chuẩn. Với mục đích xa hơn là thiết lập chất chuẩn phục vụ cho công tác kiểm nghiệm dược liệu SVD, sau khi xác định độ tinh khiết bằng SKLM và HPLC saponin chính phân lập được, do thời gian có hạn, chúng tôi mới dừng lại ở việc chiết xuất, phân lập và tinh chế. Việc thiết lập chất chuẩn stipuleanosid R2 còn cần đánh giá thêm một vài ch ỉ tiêu khác theo tiêu chí của DĐVN và Dược điển quốc tế.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Với các kết quả thực nghiệm thu được đề tài đã đạt được các mục tiêu đề ra là:
1. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế Stipuleanosid R2 t ừ dược liệu sâm vũ diệp.
2. Bước đầu xác minh cấu trúc hóa học, xây dựng bộ dữ liệu nh ậ n dạng của chất tinh chế được.
3. Định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được.
Như vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn cho hợp chất saponin chính từ thân rễ SVD – stipuleanosid R2 đã góp phần ý nghĩa vào cơ sở dữ liệu về hóa thực vật và tiêu chuẩn hóa dược liệu SVD cũng như làm cơ sở định hướng cho các nghiên cứu hoạt tính sinh học của đối tượng tiềm năng thuộc chi Panax này. Và thêm vào đó các kết quả này còn có ý nghĩa thực tiễn trong công tác kiểm nghiệm thuốc nói chung và kiểm nghiệm dược liệu nói riêng.
KIẾN NGHỊ
Hướng nghiên cứu tiếp theo, tôi xin phép được kiến nghị:
1. Nghiên cứu thiết lập tiêu chuẩn chất chuẩn stipuleanosid R2 để có tài liệu bổ sung về chất chuẩn đối chiếu trên vào Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ 6.
2. Tiến hành nghiên c ứu thiết lập các chất chuẩn đối chiếu khác có nguồn gốc dược liệu phục vụ nhu cầu kiểm tra chất lượng dược liệu cũng như các sản phẩm từ dược liệu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. TIẾNG VIỆT:
[1] Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007) Thực vật học tập 1, NXB Y học, Hà Nội.
[2] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong cùng cộng sự (2003), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 2, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, tr. 711 - 714.
[3] Bộ y tế (2017), Dược điển Việt Nam V tập 2, Nhà xuất bản y học, tr. PL-113, phụ lục 2.
[4] Bộ Y tế, Vụ khoa học và đào tạo (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản
Y học, tr. 79-82, 84-110.
[5] Nguyễn Thượng Dong, TS. Trần Công Luận, TS. Nguyễn Thị Thu Hương
(2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 263-266.
[6] GS.TS.Nguyễn Minh Đức (2013), Tổng quan chất chuẩn, Đại học Y dược TP.Hồ Chí Minh.
[7] Đỗ Văn Hào (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học của cây sâm vũ diệp thu
hái ở Tây Bắc, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Y dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
[8] Nguyễn Thị Huệ (2017), Phân tích acid oleanolic và saponin tổng số trong rễ cây sâm vũ diệp thu hái ở Sa Pa, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Y dược, Đại học
Quốc Gia Hà Nội.
[9] Dương Thị Phượng (2018), Định lượng Stipuleanosid R2 trong thân rễ Sâm vũ
diệp, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
[10] Lê Thị Tâm (2017), Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các
phân đoạn dịch chiết sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T sai et K. M. Feng) trên in vitro, Khoá luận tốt
nghiệp đại học, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
[11] Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn (2006), “Kết quả nghiên cứu về phân bố, sinh thái Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang ở Việt Nam”, Tạp chí
[14] Ngô Vân Thu (1990), Hóa học Saponin, Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, tr. 109-114.
[15] Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn hóa phân tích (2006), Hóa phân tích II, tr.17, 99-146, 173-222.
[16] Viện nghiên cứu thực vật Vân Nam (1975), “Triterpene trong cây thuộc chi nhân sâm và mối liên quan đến hệ thống phân loại, phân bố địa lý ”, Thực vật phân
loại học báo cáo, 13(2), 29-44.
B. TIẾNG ANH
[17] Agrawal PK (1992), "NMR spectroscopy in the structural elucidation of oligossacharides and glycosides", Phytochemistry, 31, pp. 1307-1330.
[18] Satinder Ahuja, Elsevier Publiccations (2003), Hand Book of Isolation and
Characterization of Impurities In Pharmaceuticals , p.119.
[19] Center for Drug Evaluation and Research Food and Drug Administration Department of Health and Human Services (1987), Guideline for submitting
supporting documentation in drug applications for the manufacture of drugs substances, p.29.
[20] Choi K. T. (2008), "Botanical characteristics, pharmacological effects and medicinal components of Korean Panax ginseng CA Meyer",
ActaPharmacologica Sinica, 29(9), 1109 – 1118.
[21] Shao-Xing Dai, Wen-Xing Li et al. (2016), "In silico identification of anti- cancer compounds and plants from traditional Chinese medicine database",
Scientific Reports, 25462.
[22] Y. Fan, D. Y. Guo, Q. Song, and T. Li (2013), "Effect of total saponin of aralia taibaiensis on proliferation of leukemia cells", Zhong Yao Cai, 36(4), pp. 604- 607.
[23] Mahato S, Kundu A (1994), "13C NMR spectra of pentacyclic triterpenoids-a complication and some salient features", Phytochemistry, 37, pp. 1517-1575.
[24] H. T. Nguyen, H. Q. Tran, T. T. Nguyen, V. M. Chau, K. A. Bui, Q. L. Pham, et
al. (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax
[26] Liu F et al. (2008), Method Development for Gypenosides Fingerprint by High
Performance Liquid Chromatography with Diode-Array Detection and the Addition of Internal Standard, pp. 389-393.
[27] Y. Satoh, S. Sakai, M. Katsumata, M. Nagasao, M. Miyakoshi, Y. Ida, et al. (1994), "Oleanolic acid saponins from root-bark of Aralia elata",
Phytochemistry, 36(1), pp. 147-152.
[28] Schwarz M et al (2009), “Herbal Reference Standards”, Planta Med, 75, 689– 703.
[29] H. F. Tang, Y. H. Yi, Z. Z. Wang, Y. P. Jiang, and Y. Q. Li (1997), "Oleanolic acid saponins from the root bark of Aralia taibaiensis", Yao XueXue Bao, 32(9), pp. 685-90.
[30] Vu Thi Thom et al (2018), “Antithrombotic Activity and Saponin Coposition of the Roots of Panax bipinnatifidus Seem. Growing in Vietnam”, Pharmacognosy
Research, 10(4), pp. 333-338.
[31] D. Q. Wang, J. Fan, B. S. Feng, S. R. Li, X. B. Wang, C. R. Yang, et al. (1989), "Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var. bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng", Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp. 593-599.
[32] Y. Weng, L. Yu, J. Cui, Y. R. Zhu, C. Guo, G. Wei, et al. (2014), "Antihyperglycemic, hypolipidemic and antioxidant activities of total saponins extracted from Aralia taibaiensis in experimental type 2 diabetic rats", J
Ethnopharmacol, 152(3), pp. 553-560.
[33] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP)
requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva.
[34] World Health Organization (2006), General guidelines for the establishment, maintenance and distribution of chemical reference substances, Genève, 3 - 24.
[35] Yuchi Zhang et al (2016), “Saponins from Panax bipinnatifidus Seem: New strategy of extraction, isolation, and evaluation of tyrosinase inhibitory activity based on mathematical calculations”, Journal of Chromatography B, 1039:79- 87.
PHỤ LỤC Phụ lục 01. Phiếu kết quả giám định mẫu