Yêu cầu: Hàm lượng không được thấp hơn 95,0% tính theo nguyên trạng. Tiến hành:
Pha mẫu hợp chất stipuleanosid R2 phân lập được: dùng cân phân tích cân chính
xác 6 mẫu, mỗi mẫu khoảng 10 mg chất phân lập vào bình định mức 20 mL, hòa tan và pha loãng vừa đủ bằng MeOH, sau đó siêu âm 10 phút, rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Pha mẫu dung dịch đối chiếu stipuleanosid R2: dùng cân phân tích cân chính xác
loãng vừa đủ bằng MeOH, siêu âm 10 phút, ly tâm lấy dịch chiết rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Tiến hành chạy HPLC với điều kiện sắc ký như đã nêu ở mục 3.3.1 Thu được kết quả sắc ký trình bày ở bảng 3.6
Bảng 3.6. Kết quả định lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
Mẫu thử Khối lượng (mg)
1 9,45 2 10,17 3 9,34 4 9,61 5 10,28 6 10,74 Hàm lượng RSD (%)
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Về chiết xuất, phân lập và tinh chế
4.1.1 Chiết xuất
Với quy trình chiết xuất dược liệu SVD bằng phương pháp chi ế t siêu âm sử dụng dung môi ethanol 70o, cất quay thu cắn toàn phần, phương pháp chiết siêu âm có ưu điểm làm tăng tốc độ chiết, giảm nhiệt độ và áp suất khi chiết. Từ cao chiết toàn phần phân đoạn lần lượt bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: ether, ethyl acetat và n-butanol thu được các cắn phân đoạn với khối lượng ether (1,26 %), EtOAc (0,59 %), BuOH (4,71%) so với nguyên liệu khô ban đầu. Hợp chất stipuleanosid R2 bản chất là một saponin phân cực, chính vì vậy việc chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần nhằm mục đích loại bỏ các thành phần không phân cực và kém phân cực tan trong dung môi ether và ethyl acetat, chuẩn bị cho bướ c phân lập được tiến hành nhanh và chính xác hơn.
4.1.2 Phân lập và tinh chế
Phân đoạn n-butanol thu được với hàm lượng cao nhất và được sử dụng để tiến hành phân lập stipuleanosid R2 bằng sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2 – MeOH theo gradient nồng độ. Kết hợp với SKLM để đánh giá từng phân đoạn thu được, cho thấy phân đoạn B4 cho sắc ký đồ trên bản mỏng có một vết màu hồng tím rõ nét phù h ợ p so với đặc tính của hợp chất cần phân lập. Sau đó chúng tôi đã tiến hành sắ c ký c ột pha đảo để tinh chế được stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD thu được 180 mg bột màu trắng. Kiểm tra độ tinh khiết của chất tinh chế được bằng phương pháp SKLM cho thấy cắn tinh chế được hiện một vết màu hồng sau đó chuyển sang màu tím, đây là đặc trưng của dẫn xuất triterpen. Kết quả này cũng góp phần đánh giá stipuleanosid R2 tinh chế được có độ tinh khiết khá cao, có thể ứng dụng phương pháp này trong việc phân lập hợp chất stipuleanosid R2 trong SVD và các dược liệu khác chứa thành phần này.
Như đã trình bày ở phần tổng quan, stipuleanosid R2 có nhiều tác dụng dược lý rất có ý nghĩa trên lâm sàng, có thể sử dụng để điều trị nhiều bệnh trong đó có tác dụng gây độc trên một số dòng tế bào ung thư. Hiện nay các tác dụng này của stipuleanosid R2 chưa được dùng nhiều trên lâm sàng nhưng nếu trong tương lai stipuleanosid R2 được nghiên cứu sử dụng rộng rãi trên người thì phâp lập và tinh chế stipuleanosid R2 là cần thiết phục vụ cho việc nghiên cứu tác dụng sinh học
như vậy thì quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế mà chúng tôi đưa ra có thể ứng dụng được.
4.2. Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng
Việc xác minh lại cấu trúc của stipuleanosid R2 tinh chế được trong dược liệu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và phân tích khối phổ (ESI-MS) đã khẳng định công thức phân tử cũng như cấu trúc của stipuleanosid R2 tinh chế được là phù hợp với lý thuyết. Đồng thời kết quả nhiệt độ nóng chảy đo được của chất phân lập được cũng góp phần khẳng định sản phẩm tinh chế của chúng tôi đúng là hợp chất stipuleanosid R2.
4.3. Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được bằngHPLC HPLC
4.3.1. Xây dựng phương pháp
Chúng tôi thực hiện xây dựng phương pháp HPLC với detector DAD để định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế đượ c. Đề tài sử dụng phương pháp phân tích định lượng saponin bằng HPLC là phương pháp được Dược điển các nước công nhận đạt yêu cầu về tính tiên tiến so với phương pháp quang phổ hay phương pháp khối lượng của phần lớn các chuyên luận dược liệu hiện nay. Đây là phương pháp có nhiều ưu điểm như có thể tiến hành đơn giản từ việc pha mẫu, chuẩn bị dung môi pha động đến tiến hành s ắ c ký. Trong khoảng nồng độ khảo sát, giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ. Phương pháp còn đảm bảo độ đúng và độ đặc hiệu cao.
Tham khảo một số tài liệu kết hợp với các điều kiện có sẵn, chúng tôi đã lựa chọn được chương trình sắc ký như mô tả ở mục 3.3.1. Với điều kiện sắc ký đã lựa chọn, chất nghiên cứu trong mẫu thử chuẩn bị từ dịch chiết n-butanol thân rễ SVD và chất phân l ậ p được tách tương đối tốt, pic cân đối, thời gian lưu hợp lý, phù hợp để định lượng thành phần trong thân rễ SVD.
4.3.2. Phân tích định tính và định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được 4.3.2.1. Định tính
Kết quả trên SKĐ chạy HPLC của 3 mẫu: stipuleanosid R2 phân lập được, cao BuOH và chất chuẩn đối chiếu đều cho pic ở thời gian lưu ở khoảng phút thứ
15. Theo các tài liệu nghiên cứu cho đến hiện nay, có thể khẳng định thời gian lưu đó là của hợp chất stipuleanosid R2.
Bằng phương pháp HPLC với detector UV đã xây dựng để định tính, định lượng stipuleanosid R2 và xác định giới hạn tạp chất liên quan của stipuleanosid R2 tinh chế được, chúng tôi đã xác định được chính xác hàm lượng stipuleanosid R2 tinh chế được là 96,22 0,11 (%) > 95,0% (tính theo nguyên trạng), đạt yêu cầu để thiết lập chất chuẩn đối chiếu.
Stipuleanosid R2 được tinh chế và xây dựng thành chất đối chi ếu sử dụng trong phân tích, xây dựng tiêu chuẩn. Với mục đích xa hơn là thiết lập chất chuẩn phục vụ cho công tác kiểm nghiệm dược liệu SVD, sau khi xác định độ tinh khiết bằng SKLM và HPLC saponin chính phân lập được, do thời gian có hạn, chúng tôi mới dừng lại ở việc chiết xuất, phân lập và tinh chế. Việc thiết lập chất chuẩn stipuleanosid R2 còn cần đánh giá thêm một vài ch ỉ tiêu khác theo tiêu chí của DĐVN và Dược điển quốc tế.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Với các kết quả thực nghiệm thu được đề tài đã đạt được các mục tiêu đề ra là:
1. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế Stipuleanosid R2 t ừ dược liệu sâm vũ diệp.
2. Bước đầu xác minh cấu trúc hóa học, xây dựng bộ dữ liệu nh ậ n dạng của chất tinh chế được.
3. Định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được.
Như vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn cho hợp chất saponin chính từ thân rễ SVD – stipuleanosid R2 đã góp phần ý nghĩa vào cơ sở dữ liệu về hóa thực vật và tiêu chuẩn hóa dược liệu SVD cũng như làm cơ sở định hướng cho các nghiên cứu hoạt tính sinh học của đối tượng tiềm năng thuộc chi Panax này. Và thêm vào đó các kết quả này còn có ý nghĩa thực tiễn trong công tác kiểm nghiệm thuốc nói chung và kiểm nghiệm dược liệu nói riêng.
KIẾN NGHỊ
Hướng nghiên cứu tiếp theo, tôi xin phép được kiến nghị:
1. Nghiên cứu thiết lập tiêu chuẩn chất chuẩn stipuleanosid R2 để có tài liệu bổ sung về chất chuẩn đối chiếu trên vào Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ 6.
2. Tiến hành nghiên c ứu thiết lập các chất chuẩn đối chiếu khác có nguồn gốc dược liệu phục vụ nhu cầu kiểm tra chất lượng dược liệu cũng như các sản phẩm từ dược liệu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. TIẾNG VIỆT:
[1] Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007) Thực vật học tập 1, NXB Y học, Hà Nội.
[2] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong cùng cộng sự (2003), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 2, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, tr. 711 - 714.
[3] Bộ y tế (2017), Dược điển Việt Nam V tập 2, Nhà xuất bản y học, tr. PL-113, phụ lục 2.
[4] Bộ Y tế, Vụ khoa học và đào tạo (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản
Y học, tr. 79-82, 84-110.
[5] Nguyễn Thượng Dong, TS. Trần Công Luận, TS. Nguyễn Thị Thu Hương
(2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 263-266.
[6] GS.TS.Nguyễn Minh Đức (2013), Tổng quan chất chuẩn, Đại học Y dược TP.Hồ Chí Minh.
[7] Đỗ Văn Hào (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học của cây sâm vũ diệp thu
hái ở Tây Bắc, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Y dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
[8] Nguyễn Thị Huệ (2017), Phân tích acid oleanolic và saponin tổng số trong rễ cây sâm vũ diệp thu hái ở Sa Pa, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Y dược, Đại học
Quốc Gia Hà Nội.
[9] Dương Thị Phượng (2018), Định lượng Stipuleanosid R2 trong thân rễ Sâm vũ
diệp, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
[10] Lê Thị Tâm (2017), Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các
phân đoạn dịch chiết sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T sai et K. M. Feng) trên in vitro, Khoá luận tốt
nghiệp đại học, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
[11] Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn (2006), “Kết quả nghiên cứu về phân bố, sinh thái Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang ở Việt Nam”, Tạp chí
[14] Ngô Vân Thu (1990), Hóa học Saponin, Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, tr. 109-114.
[15] Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn hóa phân tích (2006), Hóa phân tích II, tr.17, 99-146, 173-222.
[16] Viện nghiên cứu thực vật Vân Nam (1975), “Triterpene trong cây thuộc chi nhân sâm và mối liên quan đến hệ thống phân loại, phân bố địa lý ”, Thực vật phân
loại học báo cáo, 13(2), 29-44.
B. TIẾNG ANH
[17] Agrawal PK (1992), "NMR spectroscopy in the structural elucidation of oligossacharides and glycosides", Phytochemistry, 31, pp. 1307-1330.
[18] Satinder Ahuja, Elsevier Publiccations (2003), Hand Book of Isolation and
Characterization of Impurities In Pharmaceuticals , p.119.
[19] Center for Drug Evaluation and Research Food and Drug Administration Department of Health and Human Services (1987), Guideline for submitting
supporting documentation in drug applications for the manufacture of drugs substances, p.29.
[20] Choi K. T. (2008), "Botanical characteristics, pharmacological effects and medicinal components of Korean Panax ginseng CA Meyer",
ActaPharmacologica Sinica, 29(9), 1109 – 1118.
[21] Shao-Xing Dai, Wen-Xing Li et al. (2016), "In silico identification of anti- cancer compounds and plants from traditional Chinese medicine database",
Scientific Reports, 25462.
[22] Y. Fan, D. Y. Guo, Q. Song, and T. Li (2013), "Effect of total saponin of aralia taibaiensis on proliferation of leukemia cells", Zhong Yao Cai, 36(4), pp. 604- 607.
[23] Mahato S, Kundu A (1994), "13C NMR spectra of pentacyclic triterpenoids-a complication and some salient features", Phytochemistry, 37, pp. 1517-1575.
[24] H. T. Nguyen, H. Q. Tran, T. T. Nguyen, V. M. Chau, K. A. Bui, Q. L. Pham, et
al. (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax
[26] Liu F et al. (2008), Method Development for Gypenosides Fingerprint by High
Performance Liquid Chromatography with Diode-Array Detection and the Addition of Internal Standard, pp. 389-393.
[27] Y. Satoh, S. Sakai, M. Katsumata, M. Nagasao, M. Miyakoshi, Y. Ida, et al. (1994), "Oleanolic acid saponins from root-bark of Aralia elata",
Phytochemistry, 36(1), pp. 147-152.
[28] Schwarz M et al (2009), “Herbal Reference Standards”, Planta Med, 75, 689– 703.
[29] H. F. Tang, Y. H. Yi, Z. Z. Wang, Y. P. Jiang, and Y. Q. Li (1997), "Oleanolic acid saponins from the root bark of Aralia taibaiensis", Yao XueXue Bao, 32(9), pp. 685-90.
[30] Vu Thi Thom et al (2018), “Antithrombotic Activity and Saponin Coposition of the Roots of Panax bipinnatifidus Seem. Growing in Vietnam”, Pharmacognosy
Research, 10(4), pp. 333-338.
[31] D. Q. Wang, J. Fan, B. S. Feng, S. R. Li, X. B. Wang, C. R. Yang, et al. (1989), "Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var. bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng", Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp. 593-599.
[32] Y. Weng, L. Yu, J. Cui, Y. R. Zhu, C. Guo, G. Wei, et al. (2014), "Antihyperglycemic, hypolipidemic and antioxidant activities of total saponins extracted from Aralia taibaiensis in experimental type 2 diabetic rats", J
Ethnopharmacol, 152(3), pp. 553-560.
[33] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP)
requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva.
[34] World Health Organization (2006), General guidelines for the establishment, maintenance and distribution of chemical reference substances, Genève, 3 - 24.
[35] Yuchi Zhang et al (2016), “Saponins from Panax bipinnatifidus Seem: New strategy of extraction, isolation, and evaluation of tyrosinase inhibitory activity based on mathematical calculations”, Journal of Chromatography B, 1039:79- 87.
PHỤ LỤC Phụ lục 01. Phiếu kết quả giám định mẫu