3.1.1. Chiết xuất
Cân 500 g thân rễ SVD (độ ẩm được xác định là 7,81%), chiết bằng phương pháp chiết siêu âm ở nhiệt độ 700C với dung môi ethanol 70% trong 3 giờ (chiết 3 lần, mỗi lần 1500 mL). Các dịch chiết ethanol thu được được lọc qua gi ấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 95,9g cao chiết tổng ethanol. Cao chiết được hòa tan trong nước cất (500 mL) và tiến hành chiết phân bố lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần ether, ethyl acetat và n-butanol (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 500 mL). Các dịch chiết phân đoạn được cất thu hồi dung môi, sấy dưới áp suất giảm thu được 3 cắn tương ứng với từng phân đoạn ether (5,82 g), ethyl acetat (2,70 g) và n-butanol (21,70 g). Quá trình chiết xuất được tiến hành như trong hình 3.1
Hàm lượng cắn 3 phân đoạn trong nguyên liệu khô được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ Sâm vũ diệp
STT Phân đoạn
1 Cắn ether
2 Cắn ethyl acetat
Thân rễ SVD sau sơ chế
1. 2. 3.
Cắn
Hình 3.1 Quy trình chiết xuất stipuleanosid R2
3.1.2. Phân lập
Phân lập các chất có trong phân đoạn BuOH bằng sắc ký cột. Cột sắc ký được làm sạch, lót một lớp bông mỏng dưới đáy cột. Nhồi cột bằng phương pháp nhồi cột ướt vớ i chất nhồi cột silica gel pha thường hay silica gel pha đảo. Ổn định cột trong 24h.
Tiế n hành phân lập sắc ký sử dụng cột nhồi silica gel (Φ85 mm × 80 mm) với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2 - MeOH theo gradient nồng độ từ tỷ lệ CH2Cl2 -
Từ phân đoạn B4 (5,1 g) bằng sắc ký cột pha đảo RP18 (Φ50 mm x 350 mm) rửa giải đẳng dòng với hệ pha động MeOH - H2O (1:1, v/v, 1600 mL) loại dung môi thu được hợp chất stipuleanisid R2 (180 mg).
Phân đoạn BuOH
(21,7 g) Sắc ký cột Silica gel (Φ85 mm × 80 mm) CH2Cl2 - MeOH (5:1 0:1, v/v, 600 mL) B1 840 mg SKC pha đảo C18 (Φ50 mm × 350 mm) MeOH - H2O Stipuleanosid R2 Bột màu trắng, 180 mg
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập hợp stipuleanosid R2 từ phân đoạn n-butanol
3.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết của stipuleanosid R2 phân lập được bằng SKLM
Hợp chất stipuleanosid R2 sau khi phân lập được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM Silicagel RP-18 F254S trên cùng một bản mỏng, triển khai với hệ dung môi Methanol : H2O = 2 : 1, thu được sắc ký đồ như hình 3.3.
Hình 3.3. Sắc ký đồ của hợp chất stipuleanosid R2 phân lập được sau khi phun TT H2SO4 10% /EtOH
Nhận xét: Sau khi phun thuốc thử, SKĐ của hợp chất stipuleanosid R2 thấy
xuất hiện duy nhất vết màu hồng khá đậm, sau đó chuyển sang màu tím đặc trưng cho các dẫn xuất triterpen có hệ số Rf là 0,4. Vì vậy sơ bộ kết luận chất phân lập được là chất tinh khiết. Ngoài ra để xác định độ tinh khiết của stipuleanosid R2 phân lập được chúng tôi còn sử dụng phương pháp chuẩn hóa diện tích bằng HPLC được trình bày ở mục 3.3.2.
3.2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2 3.2.1. Đặc điểm cảm quan
Đặc điểm cảm quan của đối tượng nghiên cứu được quan sát bằng mắt thường dưới ánh sáng ban ngày: bột màu trắng.
3.2.2. Điểm chảy
Tiến hành đo điểm chảy theo DĐVN V (PL- 168, phương pháp 1 – phương pháp đo trong mao quản). Thu được kết quả là:
Bảng 3.2. Kết quả đo điểm chảy của stipuleanosid R2
Lần đo 1 2 3 Trung bình 3.2.3. Kết quả đo phổ Góc quay cực: Phổ ESI-MS:
Phổ 1H-NMR (CD3OD; 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD; 125 MHz), DEPT: xem
bảng 3.3
Bảng 3.3. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR, DEPT của hợp chất stipuleanosid R2
Vị trí C
19 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Đườ ng 1ʹ 2ʹ 3ʹ 4ʹ
20 1ʹʹ 2ʹʹ 3ʹʹ 4ʹʹ 5ʹʹ 6ʹʹ Đường 1ʹʹʹ 2ʹʹʹ 3ʹʹʹ 4ʹʹʹ 5ʹʹʹ Đường 1ʹʹʹʹ 2ʹʹʹʹ 3ʹʹʹʹ 4ʹʹʹʹ 5ʹʹʹʹ 6ʹʹʹʹ
* c của stipuleanosid R2 đo trong CD3OD [25]; aĐo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz.
Hợp chất stipuleanosid R2 được phân lập dưới dạng bột màu trắng, năng suất quay cực riêng [α] = +7,5 (c 0,2, MeOH). Hợp chất này phản ứng với H2SO4 10 % trong điều kiện hơ nóng thấy xuất hiện màu hồng khá đậm, sau đó chuyển sang màu tím đặc trưng cho các dẫn xuất triterpen. Từ số liệu phổ 13C NMR và DEPT thấy có 7 nhóm CH3, 10 nhóm CH2, 6 nhóm CH và 6 nguyên tử C bậc 4 cùng 1 nhóm COOR. Phổ 13C NMR của stipuleanosid R2 xuất hiện tín hiệu của 30 carbon đặc trưng cho một saponin có phần aglycon là một triterpene khung oleanan đã được công bố từ sâm vũ diệp [24]. Phổ 1H NMR xuất hiện 7 tín hiệu singlet của của các nhóm methyl bậc ba tại δ 0,81, 0,85, 0,93, 0,95, 0,96, 1,05, 1,17 (7 tín hiệu CH3, s, CH3-25, 26, 24, 23, 30, 29, 27), một nối đôi ở C-12/C-13 với sự có mặt của tín hiệu tại [δ 5,27 (1H, br s, H-12)]. Ngoài ra trên phổ này còn xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng trong vùng từ δ 3,0-4,0 đặc trưng cho sự có mặt của các nhóm
oxymetin và oxymethylen của 4 phân tử đường. Bốn phân tử đường bao gồm một đơn vị glucorunic acid (GluA), hai đơn vị glucose (Glc) và một arabifuranose [Ara(f)] được nhận biết bởi các tín hiệu proton anomeric tại δ 4,01 (1H, d, J = 1,0
Hz, H-1ʹ), 4,92 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1ʹʹ), 5,19 (1H, br s, H-1ʹʹʹ), 5,40 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1ʹʹʹʹ). Trên phổ 13C NMR xuất hiện tín hiệu của 53 tín hiệu nguyên tử cacbon, trong đó có 23 tín hiệu được xác định thuộc bốn đơn vị đường [GluA, 2 Glc và Ara(f)] [17] và 30 tín hiệu còn lại thuộc phần aglycon oleanolic acid với một oxymethin tại δ 91,03 (C-3), nối đôi đặc trưng C-12/C-13 tại δ 123,8 và 144,7 ppm cùng với một nhóm carbonyl acid carboxylic tại δ 178,1 (C-28) [23-24]. Hơn nữa, phổ khối ESI-MS của stipuleanosid R2 xuất hiện pic ion tại 1087 [M-H]- phù hợp với công thức phân tử C53H84O23 (M = 1088). Từ những dữ kiện phổ trên kết hợp với so sánh số liệu phổ NMR trong tài liệu đã được công bố [25] cho phép xác định cấu trúc hóa học chính xác là stipuleanosid R2 (hình 3.4).
Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất stipuleanosid R2
3.3. Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được bằngHPLC HPLC
3.3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký
Tham khảo phương pháp nghiên cứu trong đề tài “Nghiên cứu thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp” – luận văn Thạc sĩ của Nguyễn Thị Thu Thủy và
các phương pháp định lượng hợp chất saponin bằng HPLC [26], chúng tôi tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích như sau:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity
- Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm)
- Detector DAD phát hiện ở bước sóng 203nm
- Tốc độ dòng: 0,8mL/phút
- Thể thích bơm mẫu: 20µl
- Nhiệt độ: 25oC
- Dung môi pha mẫu: Methanol
- Pha động: Acetonitril (kênh A) : 0,5% acid acetic/H2O (kênh B) với chương trình gradient như bảng 3.4
Bảng 3.4. Chương trình dung môi
3.3.2. Nhận dạng pic trên sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được
Pha mẫu stipuleanosid R2 phân lập được: dùng cân phân tích cân chính xác
khoảng 1,0 mg chất rồi pha thành dung dịch tương ứng với nồng độ 1000 µg/mL trong methanol, sau đó siêu âm 10 phút, rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Pha m ẫu thử: dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 100,0 mg cao n- butanol thân rễSVD rồihòa tan trong methanol vớinồng độ100,0 mg/mL, siêuâm 10 phút, ly tâm lấy dịch chiết rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Pha mẫu chất chuẩn liên kết stipuleanosid R2: dùng cân phân tích cân chính
xác khoảng 1,0 mg stipuleanosid R2 rồi hòa tan trong methanol với nồng độ 400,0 µg/mL, siêu âm 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Tiến hành sắc ký HPLC hợp chất phân lập được và cao butanol so sánh với SKĐ thu được của mẫu chất chuẩn.
Hình 3.5. SKĐ HPLC của stipuleanosid R2 phân lập được (A), cao BuOH (B)và chất chuẩn đối chiếu (C)
Nhận xét: Kết quả phân tích HPLC minh họa cho thấy stipuleanosid R2 là hợp chất thiên nhiên có trong SVD với thông số thời gian lưu trong dung dịch cao butanol được chuẩn bị tại thời điểm chạy sắc ký với điều kiện chiết xuất chuẩn thường quy là lần lượt là 15,565 và 15.564 phút, giá trị này tương đương với thời gian lưu của chất chuẩn là 15.565 phút.
3.3.3. Định lượng stipuleanosid R2 phân lập được
Yêu cầu: Hàm lượng không được thấp hơn 95,0% tính theo nguyên trạng. Tiến hành:
Pha mẫu hợp chất stipuleanosid R2 phân lập được: dùng cân phân tích cân chính
xác 6 mẫu, mỗi mẫu khoảng 10 mg chất phân lập vào bình định mức 20 mL, hòa tan và pha loãng vừa đủ bằng MeOH, sau đó siêu âm 10 phút, rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Pha mẫu dung dịch đối chiếu stipuleanosid R2: dùng cân phân tích cân chính xác
loãng vừa đủ bằng MeOH, siêu âm 10 phút, ly tâm lấy dịch chiết rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Tiến hành chạy HPLC với điều kiện sắc ký như đã nêu ở mục 3.3.1 Thu được kết quả sắc ký trình bày ở bảng 3.6
Bảng 3.6. Kết quả định lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
Mẫu thử Khối lượng (mg)
1 9,45 2 10,17 3 9,34 4 9,61 5 10,28 6 10,74 Hàm lượng RSD (%)
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Về chiết xuất, phân lập và tinh chế
4.1.1 Chiết xuất
Với quy trình chiết xuất dược liệu SVD bằng phương pháp chi ế t siêu âm sử dụng dung môi ethanol 70o, cất quay thu cắn toàn phần, phương pháp chiết siêu âm có ưu điểm làm tăng tốc độ chiết, giảm nhiệt độ và áp suất khi chiết. Từ cao chiết toàn phần phân đoạn lần lượt bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: ether, ethyl acetat và n-butanol thu được các cắn phân đoạn với khối lượng ether (1,26 %), EtOAc (0,59 %), BuOH (4,71%) so với nguyên liệu khô ban đầu. Hợp chất stipuleanosid R2 bản chất là một saponin phân cực, chính vì vậy việc chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần nhằm mục đích loại bỏ các thành phần không phân cực và kém phân cực tan trong dung môi ether và ethyl acetat, chuẩn bị cho bướ c phân lập được tiến hành nhanh và chính xác hơn.
4.1.2 Phân lập và tinh chế
Phân đoạn n-butanol thu được với hàm lượng cao nhất và được sử dụng để tiến hành phân lập stipuleanosid R2 bằng sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2 – MeOH theo gradient nồng độ. Kết hợp với SKLM để đánh giá từng phân đoạn thu được, cho thấy phân đoạn B4 cho sắc ký đồ trên bản mỏng có một vết màu hồng tím rõ nét phù h ợ p so với đặc tính của hợp chất cần phân lập. Sau đó chúng tôi đã tiến hành sắ c ký c ột pha đảo để tinh chế được stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD thu được 180 mg bột màu trắng. Kiểm tra độ tinh khiết của chất tinh chế được bằng phương pháp SKLM cho thấy cắn tinh chế được hiện một vết màu hồng sau đó chuyển sang màu tím, đây là đặc trưng của dẫn xuất triterpen. Kết quả này cũng góp phần đánh giá stipuleanosid R2 tinh chế được có độ tinh khiết khá cao, có thể ứng dụng phương pháp này trong việc phân lập hợp chất stipuleanosid R2 trong SVD và các dược liệu khác chứa thành phần này.
Như đã trình bày ở phần tổng quan, stipuleanosid R2 có nhiều tác dụng dược lý rất có ý nghĩa trên lâm sàng, có thể sử dụng để điều trị nhiều bệnh trong đó có tác dụng gây độc trên một số dòng tế bào ung thư. Hiện nay các tác dụng này của stipuleanosid R2 chưa được dùng nhiều trên lâm sàng nhưng nếu trong tương lai stipuleanosid R2 được nghiên cứu sử dụng rộng rãi trên người thì phâp lập và tinh chế stipuleanosid R2 là cần thiết phục vụ cho việc nghiên cứu tác dụng sinh học
như vậy thì quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế mà chúng tôi đưa ra có thể ứng dụng được.
4.2. Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng
Việc xác minh lại cấu trúc của stipuleanosid R2 tinh chế được trong dược liệu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và phân tích khối phổ (ESI-MS) đã khẳng định công thức phân tử cũng như cấu trúc của stipuleanosid R2 tinh chế được là phù hợp với lý thuyết. Đồng thời kết quả nhiệt độ nóng chảy đo được của chất phân lập được cũng góp phần khẳng định sản phẩm tinh chế của chúng tôi đúng là hợp chất stipuleanosid R2.
4.3. Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được bằngHPLC HPLC
4.3.1. Xây dựng phương pháp
Chúng tôi thực hiện xây dựng phương pháp HPLC với detector DAD để định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế đượ c. Đề tài sử dụng phương pháp phân tích định lượng saponin bằng HPLC là phương pháp được Dược điển các nước công nhận đạt yêu cầu về tính tiên tiến so với phương pháp quang phổ hay phương pháp khối lượng của phần lớn các chuyên luận dược liệu hiện nay. Đây là phương pháp có nhiều ưu điểm như có thể tiến hành đơn giản từ việc pha mẫu, chuẩn bị dung môi pha động đến tiến hành s ắ c ký. Trong khoảng nồng độ khảo sát, giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ. Phương pháp còn đảm bảo độ đúng và độ đặc hiệu cao.
Tham khảo một số tài liệu kết hợp với các điều kiện có sẵn, chúng tôi đã lựa chọn được chương trình sắc ký như mô tả ở mục 3.3.1. Với điều kiện sắc ký đã lựa chọn, chất nghiên cứu trong mẫu thử chuẩn bị từ dịch chiết n-butanol thân rễ SVD và chất phân l ậ p được tách tương đối tốt, pic cân đối, thời gian lưu hợp lý, phù hợp để định lượng thành phần trong thân rễ SVD.
4.3.2. Phân tích định tính và định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được 4.3.2.1. Định tính
Kết quả trên SKĐ chạy HPLC của 3 mẫu: stipuleanosid R2 phân lập được, cao BuOH và chất chuẩn đối chiếu đều cho pic ở thời gian lưu ở khoảng phút thứ
15. Theo các tài liệu nghiên cứu cho đến hiện nay, có thể khẳng định thời gian lưu đó là của hợp chất stipuleanosid R2.
Bằng phương pháp HPLC với detector UV đã xây dựng để định tính, định lượng stipuleanosid R2 và xác định giới hạn tạp chất liên quan của stipuleanosid R2 tinh chế được, chúng tôi đã xác định được chính xác hàm lượng stipuleanosid R2 tinh chế được là 96,22 0,11 (%) > 95,0% (tính theo nguyên trạng), đạt yêu cầu để thiết lập chất chuẩn đối chiếu.
Stipuleanosid R2 được tinh chế và xây dựng thành chất đối chi ếu sử dụng trong phân tích, xây dựng tiêu chuẩn. Với mục đích xa hơn là thiết lập chất chuẩn phục vụ cho công tác kiểm nghiệm dược liệu SVD, sau khi xác định độ tinh khiết bằng SKLM và HPLC saponin chính phân lập được, do thời gian có hạn, chúng tôi mới dừng lại ở việc chiết xuất, phân lập và tinh chế. Việc thiết lập chất chuẩn stipuleanosid R2 còn cần đánh giá thêm một vài ch ỉ tiêu khác theo tiêu chí của DĐVN và Dược điển quốc tế.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Với các kết quả thực nghiệm thu được đề tài đã đạt được các mục tiêu đề ra là:
1. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế Stipuleanosid R2 t ừ dược liệu sâm vũ diệp.
2. Bước đầu xác minh cấu trúc hóa học, xây dựng bộ dữ liệu nh ậ n dạng của chất tinh chế được.
3. Định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được.
Như vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn cho hợp chất saponin chính từ thân rễ SVD – stipuleanosid R2 đã góp phần ý nghĩa vào cơ sở dữ liệu về hóa thực vật và tiêu chuẩn hóa dược liệu SVD cũng như làm cơ sở định hướng cho các nghiên cứu hoạt tính sinh học của đối tượng tiềm năng thuộc chi Panax này. Và thêm vào đó các kết quả này còn có ý nghĩa thực tiễn trong công tác kiểm nghiệm thuốc nói chung và kiểm nghiệm dược liệu nói riêng.
KIẾN NGHỊ
Hướng nghiên cứu tiếp theo, tôi xin phép được kiến nghị:
1. Nghiên cứu thiết lập tiêu chuẩn chất chuẩn stipuleanosid R2 để có tài liệu bổ