cây Xấu hổ.
Thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym α – glucosidase in vitro của dịch chiết lá cây Xấu hổ (Mimosa pudica Linn.) được tiến hành tại Vi ệ n công nghệ sinh học -Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. [37,39,31,32]
Chuẩn bị hóa chất cần thiết
Enzym Yeast -glucosidase; p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG), 4- Nitrophenol (Sigma).
Nguyên lý
Enzym α-glucosidase xúc tác quá trình chuy ể n chất nền p-nitrophenyl-α-D- glucopyranoside thành α-glucose và p-nitrophenol có màu vàng nhạt - hấp thụ cực đại tại 405 nm. Chất kìm hãm enzym làm cường độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm. Dựa vào độ hấp thụ của dung dịch khi có hoặ c không có mặt chất thử, từ đó suy ra phần trăm ức chế enzym. Dựa vào phần mềm, xác định IC50 (nồng độ của mẫu tại đó ức chế 50% enzym). Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 càng thấp.
Cách tiến hành
Hoạt tính ức chế enzym α glucosidase của hoạt chất nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp của Moradi -Afrapoli F và cộng sự. Cụ thể như sau:
- Chất thử được hòa tan trong DMSO và pha loãng trong đệm phosphate 10 mM (pH 6,8) và 50 l được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ 256 g/ml, 64 g/ml; 16 g/ml; 4 g/ml;
- 20 µl α- glucosidase (0,5U/ml) và 130 µl đệm phosphate 100 mM (pH 6,8) được thêm vào mỗi giếng, trộn đều và ủ ở 37oC trong 15 phút.
- Cơ chấ t p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) được đưa tiếp vào từng giế ng thí nghiệm rồi ủ tiếp ở 37oC trong 60 phút.
- Đĩa thí nghiệm chỉ có mẫu thử, đệm phosphate và pNPG được sử dụng làm đối chứng trắng (blank). Giếng thí nghiệm chỉ có DMSO 10%, đệm phosphate, enzyme và pNPG được sử dụng làm đối chứng. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo sự chính xác.
- Dừng thí nghiệm bằng cách thêm vào 80 µl Na2CO3 0,2M và đo OD ở bước sóng 405nm bằng máy đo ELISA Plate Reader (Bio-Rad).
Khả năng ức chế enzyme α - glucosidase của mẫu thử được xác định theo công thức sau:
% ức chế = 100 - (Amẫu thử/ A đối chứng *100)
Trong đó: A đối chứng = OD đối chứng - OD mẫu trắng đối chứng Amẫu thử = ODmẫu thử - OD mẫu trắng thử Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve2Dv4.