L ời cảm ơn
3.2.2 Phương pháp nuôi cấy và phân lập
Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí
Cách tiến hành
Mẫu thịt: Cân 1g mẫu cho vào 9 ml nước muối sinh lý (9‰), đồng nhất dung dịch mẫu có độ pha loãng là 10-1 so với ban đầu. Tiếp tục pha loãng theo dãy thập
Loại mẫu Số mẫu Số ca Số lần lấy mẫu Tổng số mẫu Chỉ tiêu phân tích Tổng số lược phân tích Thịt 6 3 2 36 4 144 Nước 1 3 2 6 4 24 Kệ giết mổ 1 3 2 6 4 24 Dao 1 3 2 6 4 24 Tổng 54 216
phân bằng cách dùng ống hút vô trùng chuyển 1 ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9 ml thành dung dịch có nồng độ 10-2, tương tự 10-3, 10- 4 và 10-5.
Mẫu nước: Hút 1 ml nước vào 9 ml nước muối sinh lý (9‰), đồng nhất dung dịch mẫu có độ pha loãng là 10-1 so với ban đầu. Tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùngống hút vô trùng chuyển 1 ml dịch mẫu vàoống nghiệm chứa 9 ml thành dung dịch có nồng độ 10-2, tương tự 10-3, 10- 4 và 10-5.
Mẫu môi trường: Để trực tiếp que tâm bông đã quệt môi trường vào 9 ml nước muối sinh lý (9‰), đồng nhất dung dịch mẫu lúc này dung dich mẫu có độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng ống hút vô trùng chuyển 1 ml dịch mẫu vàoống nghiệm chứa 9 ml thành dung dịch có nồng độ 10-2, tương tự 10-3, 10- 4 và 10-5.
Chọn 2 độ pha loãng liên tiếp sao cho có 25-300 tế bào vi khuẩn trong 1ml. Dùng ống hút vô trùng chuyển 1 ml dịch mẫu pha loãng đã chọn vào giữa đĩa petri vô trùng. Tương ứng với mỗi độ pha loãng lập lại ít nhất 2 đĩa. Sau đó, đổ vào mỗi đĩa 10-15 ml môi trường nhiệt độ 45-500C. Trộn đều dịch mẫu với môi trường đến khi thạch đông đặc, cho vào tủ ấm 370C trong 24 giờ. Môi trường: NA định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí.
Cách tính kết quả
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Đối với tổng vi khuẩn hiếu khí những những đĩa có khuẩn lạc từ 25-300 khuẩn lạc là đạt chuẩn của phương pháp. Trong 1 ml mẫu được tính như sau:
Môi trường MC Đếm khuẩn lạc E. coli 9ml 10-3 9ml 10-1 9ml 10-2 9ml 10-5 9ml 10-4 Mẫu 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Môi trường MSA Đếm khuẩn lạc Staphylococcus aureus
Kiểm tra sinh hóa
Kết luận
Kiểm tra sinh hóa Kết luận Môi trường NA Đếm khuẩn lạc VKHK
Sơ đồ 1: Quy trình phân tích tổng vi khuẩn hiếu khí,E. coli, Staphylococcus aureus.
∑C : tổng số khuẩn lạc
V : thể tích dung dịch đemsử dụng n1, n2 : số đĩa ở nồng độ pha loãng thấp nhất d : nồng độ pha loãng thấp nhất
Xác định tổng số Escherichia coli
Các bước tiến hành và định lượng vi khuẩnE. coli tương tự phương pháp xác
định tổng số vi khuẩn hiếu khí theo sơ đồ1.
Nuôi cấy trên môi trường MC định lượng E. coli, trên môi trường MC thì các khuẩn lạc E. coli tròn, khô, có màu tím, hình đĩa. Các nồng độ cho kết quả từ 10- 100 khuẩn lạc là đạt chuẩn của phương pháp xác định tổng số vi khuẩn E. coli.
Sau đó vi khuẩn được cấy chuyển để làm thuần trên các môi trường chuyên biệt cho từng loại vi khuẩn và cấy sang môi trường NA ủ 370C trong 24 giờ để khảo sát các phản ứng sinh hoá.
Phản ứng sinh hoá định danh các chủng E. coliđược thể hiện qua bảng3
Bảng3.Định danh vi khuẩnE. coli bằng phản ứng sinh hoá (Carter, 1975)
KIA Chỉ tiêu sinh hóa
Glucose Lactose H2S Gas
Indole MR VP Citrate
E. coli + + - + + + - -
Klebsiella + + - + +/- - +/- +
Enterobacter + +/- - + - - - +
Xác định vi khuẩnStaphylococcus aureus
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành và định lương vi khuẩnStaphylococcus aureus tương tự phương pháp xác định tổng sốvi khuẩn hiếu khí theo sơ đồ 1.
∑C
V(n1 + 0.1* n2)d N =
370C / 24 giờ 370C / 24 giờ TSA 370C / 24 giờ BGA MLCB BGA
Hajna Tetrathionate Broth (9ml)
Mẫu (25gram thịt)
Buffered Peptone Water (9ml) KIA LIM VP Kết luận Salmonella spp 370C / 24 giờ 370C / 24 giờ 370C / 24 gờ
Môi trường: MSA định lượng Staphylococcus aureus. Trên môi trường MSA: khuẩn lạc Staphylococcus aureus nhỏ, tròn, màu vàng, rìa gọn, khô, môi trường từ đỏ chuyển sang vàng.
Sau đó vi khuẩn được cấy chuyển để làm thuần trên các môi trường chuyên biệt cho từng loại vi khuẩn và cấy sang môi trường NA ủ 370C trong 24 giờ để khảo sát các phản ứng đông huyết tương.
Phương pháp định lượng- xác định Salmonella (TCVN 5153:1990)
Lấy 25g mẫu ở nhiều vị trí khác nhau cho vào 9ml môi trường tiền tăng sinh Buffered Peptone Water, dập mẫu, ủ ở 370C/ 24 giờ.
Dùng pipét vô trùng lấy 1ml mẫu pha loãng vào ống nghiệm có chứa 9ml môi trường tăng sinh Hajna Tetrathionate Broth, ủ ở 370C/ 24 giờ.Lấy một vòng que cấy từ môi trường tăng sinh, cấychuyển lên 2 môi trường BGA và MLCB. Sau khi cấy đem ủ ở nhiệt độ 370C, trong 24 giờ (Trên BGA, khuẩn lạc có màu đỏ nhạt, môi trường có màu đỏ, khuẩn lạc tròn bóng, bề mặt hơi lồi và trên MLCB khuẩn lạc
Salmonella to, màu đen viền xám nhạt, bề mặt hơi lồi, môi trường có màu tím xanh).
Phân lập vi khuẩn Salmonella dựa vào đặc tính sinh hoá củaSalmonella theo Elmer,
et al.2001trên môi trường KIA, LIM, VP thể hiện qua bảng4.
Bảng4.Đặc tính sinh hóa của các chủngSalmonella (Elmer ,et al. 2001)
KIA LIM VP
Vi khuẩn
Glucose Lactose H2S Lysine Indole VP Di động
S. pullorum S. gallinarum S. arizonae S. enteritidis S. choleraesuis S. typhimurium S. paratyphi + + + + + + + - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + 3.2.3 Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Minitab 13.20
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trên thân thịt, môi trường và dụng
cụ giết mổ
Bảng 5. Kết quả dương tính với vi khuẩn hiếu khí vi sinh vật trên thân thịt, môi
trường và dụng cụ giết mổ
Loại mẫu Số lượng mẫu Số mẫu nhiễm
vi sinh vật Tỷ lệ (%) Thân thịt 36 36 100 Môi trườngvà dụng cụ giết mổ 18 18 100 Tổng cộng 54 54 100
Qua bảng 5 cho thấy 54 mẫu được kiểm tra trong đó có 36 mẫu thịt,18 mẫu môi trường, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn hiếu khí đều chiếm tỷ lệ 100%. Vi khuẩn hiếu khí từ môi trường, dụng cụ giết mổ nhiễm sang thịt. Trong khi giết mổ: tình trạng vệ sinh ở cơ sở giết mổ là một trong những khâu quan trọng nhất trong dây chuyền sản xuất thịt. Việc vấy nhiễm xảy ra ở cơ sở giết mổ phân bố rộng bắt nguồn từ thú sống, dụng cụ, nước rửa, tổ chức hạ thịt và ý thức người tham gia giết mổ.
4.2. Kết quả vấy nhiễm vi sinh trên thịt heo
Bảng6. Kết quả dương tínhcác chỉ tiêu vi sinh vật trên thịt
Chỉ tiêu VKHK E. coli Stap. aureus Salmonella
Số mẫu kiểm tra 36 36 36 36
Số mẫu nhiễm 36 22 12 3
Tỷ lệ (%) 100a 61,11b 33,33c 8,33d
Bảng 6 cho thấy chất lượng mẫu thịt là rất kém vì có sự hiện diện của vi sinh vật. Việc xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thịt được coi là một tiêu chuẩn đánh giá tổng thể sự ô nhiễm vi sinh vật của thịt, đồng thời nó phản ánh toàn diện về tình trạng vệ sinh ở lò mổ. Đây là một chỉ tiêu hết sức quan trọng phải đặc biệt quan tâm.
Tổng số E. coli: dương tính 22 mẫu trong tổng số 36 mẫu khảo sát, mẫu nhiễmE. coli với tỷ lệ61,11%. Tỷ lệ này cao có thể quầy thịt đã bị nhiễm phân hay có thể bị nhiễm các vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác. Qua kết quả trên ta thấy nhiễm E. coli rất cao cho thấy tình trạng vệ sinh thú y của cơ sở giết mổ chưa tốt. Nguyên nhân có thể do E. coli là loài vi khuẩn thường hiện diện trong đất, nước, không khí, các chủng E. coli độc có thể tồn tại đến 04 tháng (Nguyễn Như Thanh, 1997), nguyên nhân quan trọng nữa là do thân thịt tiếp xúc với công nhân, quá trình giết mổ không đảm bảo vệ sinh, thịt bị nhiễm vi khuẩn từ lông, da, phân, nội tạng. Sự có mặt của E. coli được coi là có sự nhiễm bẩn phân tươi sống. Kết quả khảo sát trên cho thấy tình hình vệ sinh ở lò mổ chưa tốt, tỷ lệ quầy thịt bị nhiễm phân rất cao.
Tổng số Stap. aureus: phát hiện 12 mẫu nhiễm Stap. aureus trên 36 mẫu
kiểm tra, với tỷ lệ nhiễm chiếm tỉ lệ 33,33 %. Nguồn lây nhiễm vi khuẩn Stap. aureus có thể do thịt có thể bị nhiễm từ đất, nước, không khí và các động vật mang
trùng hoặc trong quá trình giết mổ có heo bị bệnh hoặc mang trùng làm vấy nhiễm lên các quầy thịt khác. Staphylococcus aureus là vi khuẩn nội sinh thường xuyên ở da và trong cơ thể của người và động vật. Quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm không hợp vệ sinh rất dễ nhiễm vi khuẩn này vào thực phẩm. Những người bị viêm họng, viêm xoang, đang có các ổ mủ, vết thương trên da như mụn nhọt gây ra là nguồn lây truyền bệnh (Trần Đáng, 2008).
Kết quả phân tích 36 mẫu cho thấy có 3 mẫu cho kết quả dương tính vớiSalmonella
(chiếm tỉ lệ 8,33%). Theo kết quả khảo sát mẫu thịt ở lò mổ Tư Hùng, Tam Bình, Vĩnh Long Trần Thị Thanh Trúc 2009, cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella là 27,78%.
Kết quả này cao hơn gấp 3 lần với kết quả khảo sát tại lò mổ Afiex thành phố Long Xuyên tỉnh An Giang. Có sự khác biệt lớn này là do lò mổ Afiex thành phố Long Xuyên tỉnh An Giang thực hiện giết mổ bán thủ công nên giảm được đáng kể tỷ lệ nhiễm Salmonellas so với việc mổ trên nền sàn như ở lò mổ Tư Hùng, Tam Bình, Vĩnh Long.
Để đánh giá mức độ vệ sinh và chất lượng thực phẩm, nhất là các sản phẩm có nguồn gốc từ động vật, cần thiết phải kiểm tra thêm chỉ tiêu Salmonella.
Heo bị bệnh thương hàn có chứa vi khuẩn Salmonella ở ruột, máu và các tổ chức cơ quan khác, thịt heo bệnh có rất nhiều vi khuẩn Salmonella có thể vấy nhiễm
vào quầy thịt khác (Lương Đức Phẩm, 2001).
Thân thịt tại lò mổ bị nhiễm Salmonella là do trong quá trình giết mổ bị
nhiễm từ phân gia súc, sàn giết mổ và cũng có thể từ công nhân (công nhân mang trùng và không được trang bị quần áo bảo hộ lao động sẽ làm vấy nhiễm lên thân thịt hoặc là công nhân tiếp xúc với heo bệnh, sản phẩm của heo bệnh rồi gây vấy nhiễm lên quầy thịt sạch).
4.3. Kết quả tỷ lệ nhiễm các loại vi sinh vật trên thịt heo qua các thời điểm
Bảng 7. Tỷ lệ dương tính của tổng vi khuẩn hiếu khí qua các thời điểm
Qua 36 mẫu thịt heo khảo sát tại lò mổ Afiex thành phố Long Xuyên tỉnh An Giang toàn bộ 36 mẫu đều nhiễm vi khuẩn hiếu khí. Cường độ nhiễm vi khuẩn hiếu khí tăng dần theo ca giết mổ, đầu ca, giữ ca, cuối ca lần lượt như sau: 1,245.105
CFU/dm2,1,55.105CFU/dm2, 2,35.105CFU/dm2. Cuối ca nhiễm gấp 2 lần đầu ca.
Bảng8. Tỷlệ dương tính của E. coli qua các thời điểm
Ca giết mổ Số mẫu nhiễm Tỉ lệ nhiễm (%) Xtb
(CFU/ml)
Đầu ca 12/12 100 1,245.105
Giữa ca 12/12 100 1,55.105
Cuối ca 12/12 100 2,35.105
Ca giết mổ Số mẫu nhiễm Tỉ lệ nhiễm(%) Xtb
(CFU/ml)
Đầu ca 3/12 25 0,67.102
Giữa ca 8/12 66,67 1,28.102
Tình hình nhiễm E. coli trên quầy thịt: qua 36 mẫu thịt khảo sát thì có 22 mẫu nhiễm E. coli. Cường độ nhiễmE. coli tăng dần theo ca giết mổ. Đầu ca: 0,67.102 CFU/dm2chiếm tỉ lệ 25%, giữa ca 1,28.102CFU/dm2chiếm tỉ lệ 66,67%, cuối ca 2,18.102CFU/dm2chiếm tỉ lệ 91,67%.Cuối ca nhiễm gấp 3,25 lần đầu ca.
Bảng 9. Tỷ lệ dương tính củaSalmonella qua các thời điểm
Tỷ lệSalmonella dương tính được phân tích trong các mẫu thịt lần lượt là: âm tính trên 12 mẫu thịt ở đầu ca giết mổ và 12 mẫu thịt ở giữa ca, chỉ có 3 mẫu thịt ởcuối ca dương tính tỷ lệ25%. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩnSalmonella giữa 3 ca giết mổ khác
nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê.
Thân thịt tại lò mổ bị nhiễm Salmonella là do trong quá trình giết mổ bị nhiễm từ phân gia súc, sàn giết mổ, cũng có thể từ công nhân (công nhân mang trùng và không được trang bị quần áo bảo hộ lao động sẽ làm vấy nhiễmlên thân thịt hoặc là công nhân tiếp xúc với heo bệnh, sản phẩm của heo bệnh rồi gây vấy nhiễm lên quầythịt sạch).
Bảng 10. Tỷ lệ dương tính củaStap. aureus qua các thời điểm
Ca giết mổ Số mẫu nhiễm Tỉ lệ nhiễm (%)
Đầu ca 0/12 0
Giữa ca 0/12 0
Cuối ca 3/12 25
Ca giết mổ Số mẫu nhiễm Tỉ lệ nhiễm (%) Xtb
(CFU/ml)
Đầu ca 0/12 0 0
Giữa ca 3/12 25 1,07. 102
Tình hình nhiễmStaphylococcus aureus : có 12/36 mẫu khảo sát bị nhiễm chiếm tỷ lệ là 33,33%. Cường độ nhiễm Staphylococcus aureus ở giữa ca là 1,07.102 CFU/dm2 chếm tỉ lệ 25% ,cuối ca là 1,28.102 CFU/dm2 chếm tỉ lệ 75%, sựkhác biệt về tỷ lệ nhiễm này rấtcó ý nghĩa thống kê. Tỷlệ nhiễmStaphylococcus aureus
ở lò mổ cao, đây cũng có thể là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm vì
Staphylococcus aureus sẽ gia tăng số lượng theo thời gianvà mẫu thân thịt bị nhiễm vi khuẩn có thể sẽ lây nhiễm sang các thân thịt khác trong quá trình vận chuyển và bày bán cho người tiêu dùng (Tăng Hồng Siêu, 2007).
Hiện trạng vấy nhiễm vi khuẩn tăng theo thời gian giết mổ là do các nguyên nhân.
Đầu ca giết mổ môi trường được sát trùng hằng ngày và ánh sáng mặt trời làm hạn chế số lượng vi khuẩn có trong môi trường xung quanh khu vực giết mổ. Con vật được nghỉ ngơi trong khu chờ giết mổ và được tắm rửa sạch sẽ trước khi giết mổ. Công nhân giết mổ ở đầu ca giết mổ theo đúng quy trình bán thủ công, tất cả các heo được giết mổ trên kệ bằng inox và được treo hoàn toàn lên móc. Có dội rửa môi trường giết mổ nên cũng làm hạn chế sự vấy nhiễm vi sinh vật. Giữa ca giết mổ: các chất thải của con vật trong quá trình giết mổ: phân, nước tiểu, máu, lông, nước dội rữa tăng lên ở môi trường giết mổ do không sát trùng và dội rữa kỹ trong khi mổ. Đây là nguyên nhân chính dẫn đến việc tăng tỷ lệ nhiễm vi sinh lên thịt. Ngoài ra do công nhân vừa giết mổ xong vô chuồng bắt heo phân heo dính vào người rồi trực tiếp xẻ thịt phân dính vào thịt làm khả năng vấy nhiễm tăng cao. Cuối ca giết mổ đây là thời điểm nhiễm vi sinh cao nhất trong quá trình giết mổ.Số lượng heo giết mổ cao, 150-250 con/đêm. Tất cả các chất thải của 2 ca giết mổ trước tập trung trong vào ca cuối. Heo không được tắm rửa trước khi giết mổ, heo bị vấy nhiễm phân lên cơ thể cao do heo thải ra vì bị stress ở khu chờ giết mổ ở 2 ca giết mổ trước. Môi trường giết mổ không được sát trùng, không được dội rửa sạch, công nhân trong quá trìnhđưa thịt lên móc treo thì ôm vào toàn thân người làm tăng