Trong quá trong khảo sát điều kiện sắc ký ở mục 3.3 thời gian lưu của monotropein vẫn còn khá sớm khoảng 4 phút. Để kéo dài thời lưu của monotropein có thể cho thêm acid, tuy nhiên từ kết quả khảo sát ở 3.3 cho thêm acid làm biến dạng pic khi sử dụng cột phân tích HiQ sil C18 HS. Vì vậy, chúng tôi quyết định khảo sát tốc độ dòng ảnh hưởng đến thời gian lưu.
Từ kết quả mục 3.4 cố định các thông số: -Cột: HiQ sil C18 HS (250 mm x 4,6 mm, 5 µm). -Hệ pha động: MeOH: H2O = 5 : 95. -Bước sóng phát hiện: 237 nm. -Thể tích tiêm mẫu: 15 µl. a) Tiến hành khảo sát
27
Tốc độ dòng: 1 ml/phút, 0,8 ml/phút, 0,6 ml/phút, 0,5 ml/phút.
b) Kết quả
Chúng tôi thu được kết quả khi khảo sát như sau:
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng tốc độ dòng đến thời gian lưu của monotropein Tốc độ dòng
(ml/phút) Thời gian lưu của monotropein (phút)
1 0,8 0,6 0,5 tR = 5,340 tR = 4,280 tR = 5,253 tR = 5,789
28
Nhận xét: Từ các thí nghiệm, tốc độ dòng ảnh hưởng đến thời gian lưu của monotropein. Vì đối tượng nghiên cứu là dược liệu, giá trị thời gian lưu cần lớn hơn 5 phút. Mặt khác về giới hạn độ chính xác khi đo tốc độ dòng của máy HPLC, tốc độ tối thiểu sử dụng cần lớn hơn 0,5 ml/phút (tư vấn của nhà sản xuất). Với tốc độ dòng 0,5 ml/phút cho hình ảnh pic tốt nhất, thời gian lưu hợp lý. Về độ tinh khiết, giá trị tốc độ dòng nhỏ hơn 1 ml/phút khảo sát đều xuất hiện 1 pic phụ theo sau pic chính monotropein mặc dù đạt tiêu chuẩn chất chuẩn với nồng độ lớn hơn 98%.
c) Kết luận
Qua khảo sát và căn cứ vào điều kiện thực nghiệm cho phép chúng tôi quyết định lựa chọn các điều kiện sắc ký như sau:
-Cột: HiQ sil C18HS (250mm x4,6mm, 5µm). -Hệ pha động: MeOH : H2O = 5 : 95. -Bước sóng phát hiện: 237 nm. -Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút. -Thể tích tiêm: 15 µl. -Nhiệt độ phân tích: 25ºC.
-Dung môi pha mẫu: MeOH.
3.4.3.Thẩm định phương pháp định lượng motropein trong ba kích tím Quảng Ninh.
a) Tính đặc hiệu
Tiến hành: Sắc ký đồ mẫu chuẩn monotropein và mẫu thử. Thu được kết quả về SKĐ như sau:
Hình 3.5: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp.
200 300 400 500 600 700 nm 0 50 100 150 200 250 300 350 mAU 3.717/ 1.00 237 389 480 tR = 5,789 (phút). tR = 5,810 (phút) Phổ UV - VIS của monotropein 1 1 chú thích: 1: Picmonotropein
29
Nhận xét: Trong mẫu thử xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu củapicmonotropein trong mẫu chuẩn.
Kết luận: Phương pháp có độ đặc hiệu tốt. b) Tính thích hợp hệ thống.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn như ở mục 3.5.1.
Tiêm 6 lần mẫu chuẩn. Ghi lại sắc ký đồ về thời gian lưu, diện tích pic của pic monotropein. Kết quả được ghi lại ở Bảng 3.5
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký.
STT Thời gian lưu ( phút) Diện tích pic ( mAU*s)
1 5,786 764717 2 5,785 764514 3 5,790 764804 4 5,793 763138 5 5,791 764896 6 5,789 763109 Trung bình 5,789 764196 RSD(%) 0,05 0,10
Nhận xét: RSDthời gian lưu < 1,0%, RSDdiện tích pic < 2,0% đều nằm trong khoảng cho phép. Như vậy hệ thống là phù hợp với phép định lượng monotropein với điều kiện sắc ký đã chọn.
c) Độ tuyến tính
Tiến hành khảo sát sự phụ thuốc tuyến tính giữa thời gian lưu và diện tích pic monotropein.
Từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha loãng để được các dung dịch chuẩn biến thiên theo cấp số cộng trong khoảng 10 - 70 µg/ml. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn.
30
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ tuyến tính.
dd1 dd2 dd3 dd4 dd5 dd6 dd7 Nồng độ (µg/ml) 10 20 30 40 50 60 70 Diện tích pic (mAu*s) 157138 339414 546592 764717 974060 1136880 138520 2 Phương trình hồi qui tuyến tính: y = 20381x-57513
r = 0,9999
Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic monotropein.
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy có tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic đáp ứng trong khoảng nồng độ khảo sát của monotropein với hệ số tương quan r = 0,9999. y = 20381x - 57513 R² = 0.9987 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 1600000 0 20 40 60 80
diện tích pic( mAu*s) Linear (diện tích pic(
31
d) Độ lặp lại
Chuẩn bị mẫu chuẩn: Mẫu chuẩn được chuẩn bị ở mục 3.5.1.
Chuẩn bị mẫu thử: Thực hiện như đối với mẫu thử, tiến hành riêng biệt từ cùng một mẫu bột dược liệu.
Kết quả khảo sát độ lặp lại được trình bày trong bảng sau: Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ lặp lại.
STT Lượng cân thử
(g)
Diện tích pic monotropein (mAu*s) Hàm lượng monotropein (%) 1 0,4026 763784 1,0400 2 0,4052 763893 1,0334 3 0,4012 762786 1,0422 4 0,4058 764780 1,0332 5 0,4064 764842 1,0317 6 0,4066 764916 1,0313 Trung bình 1,0353 RSD (%) 0,4462
Nhận xét: Từ kết quả trên nhận thấy RSD < 2% nên phương pháp định lượng có độ lặp lại đạt yêu cầu.
e) Độ đúng.
Pha dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,4000 g lượng bột dược liệu, thêm MeOH vừa đủ vạch 100 ml, chiết siêu âm trong vòng 2 giờ. Cùng lúc đó, chuẩn bị 9 bình định mức 100 ml như trên. Sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng, lọc thô bằng màng lọc cenlulose. Lấy chính xác 100 µl dịch chiết cho vào edoptip, thêm chính xác 100 µl lần lượt các dung dịch thuộc dãy đường chuẩn có nồng độ 20 µg/ml, 40 µg/ml, 60 µg/ml vào dịch chiết trên, lắc đều. Mỗi mức nồng độ chuẩn tiến hành trên 3 bình mẫu thử. Lọc qua màng lọc 0,22 µm, tiêm sắc ký.
32 Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ đúng. Mẫu chuẩn thêm vào (µg/ml) Lượng chuẩn thêm vào (µg) Lượng cân thử (g) Diện tích pic (mAu*s) Lượng thu hồi (µg) Lượng thử sẵn có (µg) Lượng tìm lại( µg) % Thu hồi 20 2,000 0,4026 585565 6,130 4,168 1,962 98,10 20 2,000 0,4012 584897 6,123 4,154 1,969 98,43 20 2,000 0,4051 590054 6,177 4,194 1,983 99,16 40 4,000 0,4045 779575 8,161 4,188 3,973 99,34 40 4,000 0,4018 777226 8,105 4,159 3,946 98,67 40 4,000 0,4058 778524 8,150 4,201 3,949 98,73 60 6,000 0,4016 969573 10,150 4,158 5,992 99,86 60 6,000 0,4032 971293 10,168 4,174 5,994 99,90 60 6,000 0,4071 968045 10,134 4,215 5,919 98.65 Trung bình 99,03 RSD( %) 0,66
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy tỷ lệ tìm lại chuẩn nằm trong khoảng từ 98,0% đến 102,0% với RSD < 2%. Vậy phương pháp phân tích đã xây dựng đạt yêu cầu về độ đúng.
3.4.4. Áp dụng phương pháp phân tích xác định hàm lượng monotropein trong ba kích tím Quảng Ninh.
Cân khoảng 0,4060 g dược liệu, tiến hành chiết xuất theo quy trình chiết xuất như trên. Tiến hành tiêm sắc ký, thu được kết quả về diện tích pic, xác định được hàm lượng monotropein trong ba kích tím Quảng Ninh là 1,0343%.
3.5. Bàn luận
3.5.1. Phương pháp xử lý mẫu dược liệu
Đối tượng chúng tôi tiến hành nghiên cứu là dược liệu nên việc khảo sát và lựa chọn điều kiện chiết là hết sức quan trọng để loại bỏ các hợp chất khác trong dược liệu. Mặc khác các hoạt chất trong dược liệu dễ bị phân hủy khi tiếp xúc với không khí và nhiệt độ nên chúng tôi sử dụng phương pháp chiết 1 lần duy nhất để giảm thời gian
33
chiết, chiết trong bể siêu âm (nhiệt độ khoảng 45°C) để hạn chế ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ ổn định của chất mà vẫn tăng độ tan và tốc tộ khuếch tán của hoạt chất ra dung môi. Chúng tôi sử dụng dung môi chiết là MeOH để là dung môi có khả năng hòa tan tốt các các hoạt chất trong nhóm iridoid mà hạn chế hòa tan các hoạt chất thuộc các nhóm khác như đường, polysaccharide, anthraquinone.
3.5.2. Khảo sát độ ổn định của 2 chất chuẩn monotropein và asperuloside trong nghiên cứu.
Do phương pháp nghiên cứu sử dụng là định lượng bằng RP-HPLC do đó chúng tối tiến hành khảo sát độ ổn định của 2 chất chuẩn trong thời gian ngắn (24 giờ). Kết quả monotropein vẫn ổn định, trong khi asperuloside bị phân hủy thể hiện qua sắc ký đồ của asperuloside bị tách làm 2 pic sau 24 giờ. So với các nghiên cứu về monotropein và asperuloside đã công bố trên thế giới và tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về độ ổn định của chất chuẩn trước khi phân tích, chúng tôi đã tiến hành khảo sát độ ổn định của 2 chất trước khi xây dựng phương pháp định lượng.
3.5.3. Khảo sát điều kiện chạy HPLC xây dựng phương pháp định lượng monotropein trong ba kích tím Quảng Ninh.
Các nghiên cứu trước đã công bố [7], [19], [22], [23] các tác giả tập trung vào khảo khát hệ pha động có bổ sung thêm H3PO4 và HCOOH với nồng độ dưới 1%, tuy nhiên trong quá trình khảo sát thêm acid làm biến đổi hình dạng pic nguyên nhân có thể do cột. Ngoài ra việc thêm acid khi chạy lâu ngày có thể gia tăng nguy cơ hỏng cột nên chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng đến thời gian lưu. Tại tốc độ dòng 0,5 ml/phút cho hình ảnh pic cân đối, hình ảnh SKĐ của mẫu chuẩn giống với mẫu thử, luôn có 1 pic tạp ngay sau pic chất phân tích.
Kết quả cho thấy phép định lượng đạt yêu cầu về độ đặc hiệu, độ lặp lại, độ thích hợp hệ thống, độ đúng, khoảng tuyến tính từ 10 - 70 µg/ml với r = 0,999.
So với kết quả về hàm lượng monotropein khoảng 1,04% trong ba kích trồng tại Lục Ngạn, Bắc Giang từ Luận văn Thạc sĩ Dược học “Nghiên cứu, chiết xuất và phân
lập monotropein từ ba kích làm nguyên liệu thiết lập chuẩn” của tác giả Bùi Quốc
Thái, hàm lượng monotropein trong ba kích tím Quảng Ninh là 1,0343%. Việc hàm lượng thấp hơn này có thể là do mẫu ba kích nghiên cứu từ cây ba kích tím mới chỉ được trồng 2 năm nên hàm lượng có thể thấp hơn. Việc khảo sát sự thay đổi của tốc độ
34
dòng ảnh hưởng đến thời gian lưu của monotropein thay vì sử dụng acid trong pha động đã hạn chế được tác động của acid đến độ bền của cột phân tích.
35
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
Sau khi khảo sát hai phương pháp chiết bằng siêu âm và soxhlet với dung môi MeOH và EtOH dựa trên đánh giá phổ sắc kí RP-HPLC, quy trình chiết mẫu với ba kích tím Quảng Ninh đã được tối ưu. Các thông số của quá trình chiết xuất.
-Phương pháp chiết xuất: siêu âm, chiết 1 lần.
-Lượng dược liệu: 0,4 g.
-Loại dung môi: MeOH.
-Thể tích dung môi: 100 ml.
-Thời gian chiết: 2 giờ.
Sau thời gian 2 giờ, để nguội dịch chiết về nhiệt độ phòng, lọc qua màng lọc cenlulose bảo quản dịch chiết ở ngăn mát trong tủ lạnh.
Nhận thấy trong quá trình khảo sát và đánh giá độ ổn định bằng RP-HPLC, asperuloside chuẩn trong dung môi pha mẫu là MeOH đã không đủ điều kiện để là chất chuẩn trong phép định lượng iridoid trong ba kích tím Quảng Ninh. Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phương pháp định lượng monotropein trong cây ba kích tím Quảng Ninh bằng RP-HPLC .
Điều kiện phân tích như sau:
-Cột chạy sắc ký: Qua khảo sát lựa chọn cột HiQ sil C18 HS (250 mm x 4,6 mm, 5 µm).
-Hệ pha động: MeOH : H2O = 5 : 95.
-Thể tích tiêm: 15 µl.
-Bước sóng phát hiện: 237 nm.
-Dung môi pha mẫu: MeOH.
-Tốc độ dòng: 0.5 ml/phút.
Phương pháp đã đạt độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ lặp lại, độ đúng, khoảng tuyến tính từ 10 µg/ml đến 70 µg/ml khi nghiên cứu với chất chuẩn và dược liệu ba kích tím Quảng Ninh.
4.2. Kiến nghị.
Chúng tôi có một số kiến nghị sau:
36
-Nghiên cứu độ ổn định của asperuloside trong các dung môi khác để lựa chọn dung môi tối ưu đảm bảo độ ổn định cho chất chuẩn.
-Tiến hành xác định LOD, LOQ của phương pháp định lượng bằng RP-HPLC.
-Trong quá trình thực nghiệm chúng tôi nhận thấy thời gian lưu của monotropein khá sớm. Tham khảo một số tài liệu và luận văn, các tác giả thường cho thêm acid phosphoric 0,5%, 0,1% hoặc acid formic 0,1% vào pha động để cải thiện thời gian lưu và tính cân đối của pic [7], [20], [23], [24]. Tuy nhiên thực tế khảo sát khi cho thêm acid phosphoric nồng độ 0,1%, và acid formic 0,1% làm biến dạng pic khi sử dụng cột phân tích là HiQ sil C18 HS trong phép định lượng. Thời gian lưu của monotropein có thể thay đổi bằng cách giảm tỷ lệ MeOH hoặc tốc độ dòng. Do khi tỷ lệ nước cao với độ nhớt lớn, dễ làm hỏng bơm, tỷ lệ MeOH tối thiểu là 5%. Tốc độ dòng thay đổi làm ảnh hưởng đến thời gian lưu của monotropein. Mặc dù vậy thời gian lưu vẫn sớm. Nhận thấy tại tốc độ dòng từ 0,8 ml/phút đến 0,5 ml/phút đều thấy xuất hiện pic phụ ngay sau pic monotropein và phổ đồ có hình dạng giống như trong dược liệu ba kích tím Quảng Ninh. Do vậy, chúng tôi kiến nghị có thể tiếp tục nghiên cứu pic phụ để tạo thành chất chuẩn nhằm nâng cao khả năng nhận diện ba kích tím Quảng ninh cũng như thay đổi sang phương pháp pha thuận của HPLC để nghiên cứu monotropein.
37
TÀI LIỆU THAM KHẢO. Tiếng Việt.
1. Bộ Y tế (2004), Bài giảng dược liệu tập 1, NXB Y học, Hà Nội, tr 191 - 252.
2. Bộ Y tế(2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội, tr 682 - 68, PL 119 - 123.
3. Bộ Y tế (2006), Dược học cổ truyền, NXB Y học Hà Nội, tr 280. 4. Bộ Y tế (2007), Hóa phân tích, NXB Y học, Hà Nội, tr 69 - 212.
5. Bộ Y tế(2006), Kỹ thuật chiết xuất dược liệu, NXB Y, Hà Nội, tr 1 - 20.
6. Nguyễn Thị Lê (2017), Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng rubiadin trong dược liệu Ba kích bằng HPLC, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường
Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 1 - 30.
7. Bùi Quốc Thái (2016), Nghiên cứu, chiết xuất và phân lập monotropein từ ba kích
làm nguyên liệu thiết lập chuẩn, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược
Hà Nội, Hà Nội, tr 1 - 35.
8. Viện Kiểm nghiệm VSATTP (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa
học và vi sinh vật, NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr 15 - 59.
Tiếng Anh.
9. Choi jongwon, Lee Kyung Tae, Choi Kyung Tae, Nam Jung Hwan, Jung Hyun Ju, Park Sun Kyu (2005),“Antinociceptive Anti-inflammatory Effect of Monotropein Isolated from the Root of Morinda officinalis”, Biological & Pharmaceutical Bulletin, ,28, pp 1915 - 1918.
10. Cui Chengbin, Yang Ming, Yao Zhiwei, Cai Bing, Luo Zhipu; Xu Yukun and Chen Yuhua (1995), “Studies on the Antidepressant Active Constituents in the Roots of Morinda officinalis How”,China journal of Chinese materia medica.
11. FujikawaTakahiko, Hirata Tetsuya, Hosoo Shingo, Nakajima Kenji, Wada,Yutaka Yurugi, Hideaki Soya, Takashi Matsui, Akihiko Yamaguchi, Masato Ogata,Sansei Nishibe (2012), ”Asperuloside stimulates metabolic function in rats across several organs under high-fat diet conditions, acting like the major ingredient of Eucommialeaves with anti-obesity activity”, Journal of nutritional science.
12. Li YF, Yuan L, Xu YK, Yang M, Zhao YM (2002), “Antistress effect of oligosaccharides extracted from Morinda officinalis in mice and rats”, Research Gate.
38
13. Li Nan, Qin Lu-Ping , HanTing ,Wu Yan-Bin, Zhang Qiao-Yan, Zhang Hong (2009), ”Inhibitory Effects of Morinda officinalis Extract on Bone Loss in Ovariectomized Rats”, US Natinoal Library of Medicine National Institutes of Health . 14. U.S.National Library of Medicine (2005),”Monotropein”, 8600 Rockville Pike, USA.
15. U.S.National Library of Medincine (2005), “Asperuloside”, 8600 Rockville Pike, USA.
16. Soon Y Y, Tan B K H (2002), “Evaluation of the Hypoglycemic and Anti Oxidant Activities of Morinda officinalis in Streptozotocin-induced Diabetic Rats “, US National Library of Medicine National Institues of Health.