Sau khi lựa chọn được điều kiện sắc ký cùng với khảo sát độ ổn định của chất chuẩn, thẩm định qui trình định lượng với các nội dung sau: độ đặc hiệu, tính thích hợp hệ thống, độ lặp lại, khoảng tuyến tính, độ đúng [2], [7], [8], [23].
a) Độ đặc hiệu
-Tiến hành: Tiêm lần lượt dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử vào hệ thống, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi nhận SKĐ [2], [7], [8].
-Yêu cầu: Trên SKĐ của mẫu thử phải cho pic của chất phân tích có thời gian lưu tương ứng với pic trên SKĐ của mẫu chuẩn. Trên SKĐ của mẫu trắng không cho pic có thời gian lưu tương ứng với pic của chất phân tích nếu có đáp ứng thì phải nhỏ hơn 1% so với pic chất phân tích trong mẫu thử. Phổ hấp thụ tử ngoại của pic tương ứng với chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn phải tương ứng nhau [2], [7], [8].
18
-Tiến hành: Tiêm lặp lại 6 lần mẫu chuẩn có nồng độ thích hợp, và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi SKĐ và xác định thời gian lưu, diện tích, hệ số bất đối của pic tính theo pic chất phân tích. Tính RSD (%) của diện tích pic và thời gian lưu [2], [7], [8].
-Yêu cầu: RSDthời gian lưu ≤ 1,0 %, RSDdiện tích pic ≤ 2,0% [2], [7].
c) Độ lặp lại
-Tiến hành: Xác định hàm lượng của chất phân tích có trong 6 mẫu thử đã chuẩn bị, xác định RSD của kết quả định lượng.
-Yêu cầu: RSDthời gian lưu ≤ 1,0 %, RSDdiện tích pic ≤ 2,0 % [2], [7].
d) Độ tuyến tính
-Tiến hành: Sử dụng các mẫu chuẩn có nồng độ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 µg/ml . Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích có trong mẫu.
-Yêu cầu: Hệ số tương quan tuyến tính r ≥ 0,995 [8].
e) Độ đúng
-Tiến hành: Định lượng chất phân tích ở ba mức nồng độ khác nhau 30, 40, 50 µg/ml bằng cách thêm chất chuẩn có nồng độ lần lượt là 20, 40, 60 µg/ml vào mẫu thử. Mỗi mức nồng độ chia làm 3 mẫu. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Tính tỷ lệ lượng chất phân tích thu hồi lại được so với lượng thêm vào.
-Yêu cầu: Tỷ lệ phục hồi từ 98,0 - 100,0%, RSDdiện tích pic ≤ 2,0% [2], [7], [8].