2.3.1. Tối ưu quy trình chiết xuất iridoid từ ba kích tím Quảng Ninh
Rễ ba kích rút lõi, chia nhỏ, sấy khô sau đó nghiền thành bột đem đi kiểm tra chất lượng theo chuyên luận ba kích - DĐVN IV. Chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất ba kích với mục tiêu sử dụng trong định lượng bằng RP-HPLC. Qua tham khảo các tài liệu [5], [7], [20], [23], [24] các yếu tố khảo sát ảnh hưởng đến quá trình chiết monotropein và asperuloside bao gồm:
-Phương pháp chiết:Khảo sát phương pháp chiết siêu âm và hồi lưu.
-Dung môi chiết tiến hành khảo sát dung môi: Methanol, ethanol 96, methanol - nước (1:1).
-Khảo sát thời gian chiết: 1 giờ, 2 giờ.
17 -Khảo sát thể tích dung môi chiết: 25, 100 ml.
2.3.2. Khảo sát điều kiện HPLC trong định lượng iridoid
-Khảo sát điều kiện sắc ký dựa vào các tài liệu như các bài báo khoa học, các nghiên cứu đã công bố trên thế giới và tại Việt Nam [7], [20], [23], [24], lựa chọn chương trình sắc ký thích hợp nhất.
-Dựa theo cấu trúc phân tử và cấu trúc hóa học của hoạt chất được chiết từ dược liệu để tìm các điều kiện sắc ký phù hợp như:
• Thành phần pha động.
• Bản chất pha tĩnh.
• Bước sóng phát hiện.
• Tốc độ dòng chảy.
• Thể tích tiêm mẫu.
• Dung môi pha mẫu.
2.3.3. Khảo sát độ ổn định của monotropein và asperuloside.
Pha 2 dung dịch chất chuẩn monotropein nồng độ 1 mg/ml và asperuloside nồng độ 1,2 mg/ml trong dung môi methanol, từ 2 dung dịch chuẩn trên pha thành hỗn hợp chuẩn monotropein và asperuloside có nồng độ lần lượt là 20 µg/ml và 24 µg/ml. Bảo quản tất cả các dung dịch chuẩn trong lọ có màu, bọc giấy bạc, ở điều kiện 4ºC. Theo dõi độ ổn định của chất trong 24 h.
2.3.4. Thẩm định phương pháp phân tích.
Sau khi lựa chọn được điều kiện sắc ký cùng với khảo sát độ ổn định của chất chuẩn, thẩm định qui trình định lượng với các nội dung sau: độ đặc hiệu, tính thích hợp hệ thống, độ lặp lại, khoảng tuyến tính, độ đúng [2], [7], [8], [23].
a) Độ đặc hiệu
-Tiến hành: Tiêm lần lượt dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử vào hệ thống, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi nhận SKĐ [2], [7], [8].
-Yêu cầu: Trên SKĐ của mẫu thử phải cho pic của chất phân tích có thời gian lưu tương ứng với pic trên SKĐ của mẫu chuẩn. Trên SKĐ của mẫu trắng không cho pic có thời gian lưu tương ứng với pic của chất phân tích nếu có đáp ứng thì phải nhỏ hơn 1% so với pic chất phân tích trong mẫu thử. Phổ hấp thụ tử ngoại của pic tương ứng với chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn phải tương ứng nhau [2], [7], [8].
18
-Tiến hành: Tiêm lặp lại 6 lần mẫu chuẩn có nồng độ thích hợp, và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi SKĐ và xác định thời gian lưu, diện tích, hệ số bất đối của pic tính theo pic chất phân tích. Tính RSD (%) của diện tích pic và thời gian lưu [2], [7], [8].
-Yêu cầu: RSDthời gian lưu ≤ 1,0 %, RSDdiện tích pic ≤ 2,0% [2], [7].
c) Độ lặp lại
-Tiến hành: Xác định hàm lượng của chất phân tích có trong 6 mẫu thử đã chuẩn bị, xác định RSD của kết quả định lượng.
-Yêu cầu: RSDthời gian lưu ≤ 1,0 %, RSDdiện tích pic ≤ 2,0 % [2], [7].
d) Độ tuyến tính
-Tiến hành: Sử dụng các mẫu chuẩn có nồng độ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 µg/ml . Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích có trong mẫu.
-Yêu cầu: Hệ số tương quan tuyến tính r ≥ 0,995 [8].
e) Độ đúng
-Tiến hành: Định lượng chất phân tích ở ba mức nồng độ khác nhau 30, 40, 50 µg/ml bằng cách thêm chất chuẩn có nồng độ lần lượt là 20, 40, 60 µg/ml vào mẫu thử. Mỗi mức nồng độ chia làm 3 mẫu. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Tính tỷ lệ lượng chất phân tích thu hồi lại được so với lượng thêm vào.
-Yêu cầu: Tỷ lệ phục hồi từ 98,0 - 100,0%, RSDdiện tích pic ≤ 2,0% [2], [7], [8].
2.3.5. Phương pháp xứ lý số liệu
-Các số liệu được tính toán và xử lý thống kê bằng Microsoft Excel.
-Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn.
19
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Quy trình chiết xuất iridoid từ rễ cây ba kích tím Quảng Ninh
Do độ tan và độ ổn định của monotropein và asperuloside nói riêng và iridoid nói chung trong các dung môi ethanol, methanol, nước kết hợp cùng khảo sát phân tích bằng RP-HPLC chúng tôi đã lựa chọn điều kiện chiết xuất như sau:
-Dung môi chiết: MeOH.
-Thời gian chiết: 2 giờ.
-Lượng dược liệu: 0,4 g.
-Thể tích dung môi: 100 ml.
-Điều kiện chiết: Siêu âm, chiết 1 lần.
3.1.1. Chuẩn bị dược liệu
Ba kích đem sấy ở nhiệt độ 60ºC, xay nhỏ, đo độ ẩm. Sau đó kiểm tra các chỉ tiêu theo chuyên luận ba kích - DĐVN IV.
3.1.2. Chiết xuất iridoid
Tiến hành cân khoảng 0,4 g bột dược liệu, siêu âm 2 giờ trong 100 ml MeOH. Để nguội về nhiệt độ phòng, lọc thô qua màng lọc cenlulose, dịch lọc được bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh.
3.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký HPLC
3.2.1. Cố định thông số
Từ các tài liệu tham khảo [7], [20], [23], [24] và điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi cố định các thông số.
-Cột: HiQ sil C18 HS (250 mm x 4,6 mm, 5 µm).
-Nhiệt độ cột: 25ºC.
-Thể tích tiêm: 10 µl.
-Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
3.2.2. Tiến hành khảo sát các thông số thay đổi
-Bước sóng phát hiện: Ghi phổ trong khoảng bước sóng 190 - 800 nm, từ đó xác định bước sóng hấp thụ cực đại của 2 chất.
-Hệ pha động:Tiến hành khảo sát 9 hệ pha động.
3.2.3. Kết quả
-Bước sóng phát hiện: Quét phổ UV-VIS của monotropein và asperuloside từ 190 - 800 nm thu được hình ảnh phổ như sau:
20
Hình 3.2: Phổ UV - VIS của monotropein (bên trái) và asperuloside (bên phải).
Nhận xét: Cả 2 chất đều có cực đại hấp thụ ở 237 nm, vậy lựa chọn bước sóng này làm bước sóng phát hiện.
-Lựa chọn dung môi pha động
Phương pháp phân tích RP-HPLC thường sử dụng 3 dung môi phổ biến là MeOH, ACN, H2O. Tiến hành khảo sát 4 hệ pha động sử dụng các dung môi MeOH, ACN, H2O. Chúng tôi thu được kết quả như sau:
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát pha động của 2 chất chuẩn.
Hệ SKĐ với bước sóng = 237 nm (phút) Hệ 1 t (phút) %MeOH %H2O 0 20 80 60 80 20 tR1 = 2,742 tR2 = 13,411 200 300 400 500 600 700 nm 0 50 100 150 200 250 300 350 mAU 3.717/ 1.00 237 389 480 1 2
21 Hệ 2 t (phút) %MeOH %H2O 0 5 95 20 5 95 21 50 50 60 80 20 tR1 = 3,447 tR2 = 28,315 Hệ 3 t (phút) %ACN %H2O 0 20 80 60 80 20 tR1 = 3,365 tR2 = 5,107 Hệ 4 t (phút) %ACN %H2O 0 5 95 20 50 50 21 50 50 60 80 20 tR1 = 3,568 tR2 = 13,422
Chú thích: 1: Picmonotropein, 2: Picasperuloside.
Nhận xét: Từ kết quả thu được, dung môi ACN có 2 nhược điểm so với dung môi MeOH bao gồm giá thành của ACN đắt cũng như độc tính cao hơn do có thể thấm qua
1 2 1 2 1 2 2
22
da. Thực nghiệm chỉ ra thời gian lưu của monotropein vẫn nhỏ hơn 5 phút khi dùng 5% MeOH hoặc 5% ACN. Bên cạnh đó, độ nhớt của ACN thấp hơn dẫn tới tỷ lệ nước cao hơn nếu muốn giá trị thời gian lưu của monotropein tăng khi so sánh vơi MeOH. Do vậy, hệ dung môi MeOH : H2O được lựa chọn.
Theo khuyến cáo của nhà sản xuất, hệ dung môi pha động trong RP-HPLC nồng độ H2O không vượt quá 95% (kênh B) do độ nhớt của nước có thể tăng áp lực cũng như ảnh hưởng đến chất lượng bơm khi kênh A chuyển đột ngột trạng thái sang hoạt động. Với nồng độ 100% H2O trong thời gian kích hoạt có thể làm hoà tan các chất tạo cột RP-HPLC. Do đó, giới hạn 5% MeOH tại thời điểm ban đầu được cố định. Cố định tỷ lệ MeOH trong khoảng thời gian từ 0 - 10 phút là 5% thì thời gian lưu của monotropein không thay đổi. Trong khoảng thời gian từ 11 - 30 phút thay đổi tỷ lệ MeOH từ 40 %, 45%, 50%. Chúng tôi thu được kết quả SKĐ của 2 chất monotropein và asperuloside như sau:
Hình 3.3: Kết quả sắc ký đồ của monotropein khảo sát hệ 5.
23
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát pha động hệ 5, 6, 7.
Hệ Kết quả SKĐ của asperuloside
Hệ 5. t(phút) %MeOH %H2O 0 5 95 10 5 95 11 40 60 30 40 60 tR asperuloside = 28,442 phút Hệ ³ t (phút) %MeOH %H2O 0 5 95 10 5 95 11 45 55 30 45 55 tR asperuloside = 19,534 phút Hệ Ø t (phút) %MeOH %H2O 0 5 95 10 5 95 11 50 50 30 50 50 tR asperuloside = 19,147 phút
Chú thích:1:picmonotropein, 2: Picasperuloside.
Nhận xét: Giá trị 50% MeOH trong khoảng thời gian 11 - 30 phút được lựa chọn để thời gian thay đổi dung môi đột ngột từ 5% MeOH không làm hỏng cột. Tỷ lệ MeOH từ 40% - 50% trong khoảng thời gian từ 11 - 30 phút thì thời gian lưu của asperuloside không thay đổi nhiều. Vì vậy chúng tôi quyết định lựa chọn hệ 7 để tiếp tục khảo sát thêm khi khoảng cách giữa 2 pic không cách nhau xa. Nhận thấy thời gian lưu của monotropein là 3,41 phút vẫn khá sớm, chúng tôi tiếp tục khảo sát hệ 7 bằng
2
2
2 1
24
cách dùng acid phosphoric 0,1% và acid formic 0,1% vào kênh nước. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng acid đến SKĐ của hỗn hợp chuẩn. Khảo sát hệ pha động bổ
sung acid vào pha nước Kết quả SKĐ
Acid phosphoric 0,1%
Acid formic 0,1%
Nhận xét: Khi thêm acid vào pha động làm thay đổi hình dạng pic sắc ký khi cột được khảo sát là HiQ sil C18HS. Qua khảo sát, từ hình ảnh khi khảo sát hệ 7 chúng tôi quyết định lựa chọn hệ pha động:
Thời gian(phút) %MeOH % H2O
0 ² 95
10 ² 95
11 50 50
30 50 50
3.2.4. Kết luận
Qua khảo sát chúng tôi quyết định lựa chọn điều kiện chạy sắc ký như sau:
-Cột chạy sắc ký: Qua khảo sát lựa chọn cột HiQ sil C18 HS (250 mm x 4,6 mm, 5µm).
25
Thời gian (phút) %MeOH H2O
0 5 95 10 5 95 11 50 50 30 50 50 -Thể tích tiêm: 10 µl. -Tốc độ dòng chảy: 1 ml/phút. -Bước sóng phát hiện: 237 nm.
-Dung môi pha mẫu: MeOH.
3.3. Khảo sát độ ổn định của Monotropein và Asperuloside.
Pha dung dịch monotropein chuẩn gốc nồng độ 1 mg/ml, dung dịch asperuloside chuẩn gốc nồng độ 1,2 mg/ml trong dung môi MeOH. Từ 2 dung dịch chuẩn của 2 chất, pha thành hỗn hợp chuẩn 2 chất monotropein và asperuloside có nồng độ lần lượt là 20 µg/ml, 24 µg/ml. Bảo quản trong lọ màu, bọc giấy bạc, tránh ánh sáng ở nhiệt độ dưới 4ºC. Theo dõi độ ổn định của chất trong 24 h. Kết quả khảo sát độ ổn định của monotropein và asperuloside như sau:
Hình 3.4: SKĐ khảo sát độ ổn định của hỗn hợp chuẩn monotropein và asperuloside Chú thích:1: Picmonotropein, 2: Picasperuloside
1
2
Sau 8 giờ Sau 16 giờ
26
Kết luận: Do không ổn định sau 24 giờ trong dung môi MeOH, asperuloside bị loại bỏ trong các nghiên cứu tiếp theo. Monotropein chuẩn vẫn ổn định sau thời gian khảo sát. Thời gian nghiên cứu có hạn, độ ổn định của monotropein trong điều kiện dài hạn và thay đổi dung môi pha mẫu khác đã không được nghiên cứu. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện chạy HPLC và thẩm định phương pháp định lượng monotropein trong ba kích tím Quảng Ninh.
3.4. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích monotropein trong ba kích tím Quảng Ninh tím Quảng Ninh
3.4.1. Chuẩn bị mẫu
-Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,0020 g monotropein sử dụng dung môi
MeOH pha thành dung dịch chuẩn gốc với nồng độ 2 mg/ml. Pha loãng dung dịch chuẩn gốc 10 lần thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 200 µg/ml. Từ dung dịch chuẩn tiếp tục pha loãng thành dung dịch nồng độ 40,00 µg/ml. Dung dịch 40 µg/ml lọc qua màng lọc 0,22 µm sau đó được dùng để tiêm vào hệ thống sắc ký.
-Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,4000 g bột dược liệu ba kích tím Quảng Ninh (
đã được nghiền mịn, rây qua rây có kích thước 0,25 mm), cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung MeOH đến vạch, bịt kín. Đặt trong bể siêu âm nhiệt độ 45ºC trong vòng 2 giờ. Sau đó để nguội bình chiết về nhiệt độ phòng, bổ sung MeOH đến vạch, lọc thô.qua màng cenlulose. Để dịch lọc trong ngăn mát tủ lạnh qua đêm. Tiến hành lọc qua màng lọc 0,22 µm thu được dung dịch thử đem chạy HPLC.
3.4.2. Lựa chọn điều kiện chạy HPLC.
Trong quá trong khảo sát điều kiện sắc ký ở mục 3.3 thời gian lưu của monotropein vẫn còn khá sớm khoảng 4 phút. Để kéo dài thời lưu của monotropein có thể cho thêm acid, tuy nhiên từ kết quả khảo sát ở 3.3 cho thêm acid làm biến dạng pic khi sử dụng cột phân tích HiQ sil C18 HS. Vì vậy, chúng tôi quyết định khảo sát tốc độ dòng ảnh hưởng đến thời gian lưu.
Từ kết quả mục 3.4 cố định các thông số: -Cột: HiQ sil C18 HS (250 mm x 4,6 mm, 5 µm). -Hệ pha động: MeOH: H2O = 5 : 95. -Bước sóng phát hiện: 237 nm. -Thể tích tiêm mẫu: 15 µl. a) Tiến hành khảo sát
27
Tốc độ dòng: 1 ml/phút, 0,8 ml/phút, 0,6 ml/phút, 0,5 ml/phút.
b) Kết quả
Chúng tôi thu được kết quả khi khảo sát như sau:
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng tốc độ dòng đến thời gian lưu của monotropein Tốc độ dòng
(ml/phút) Thời gian lưu của monotropein (phút)
1 0,8 0,6 0,5 tR = 5,340 tR = 4,280 tR = 5,253 tR = 5,789
28
Nhận xét: Từ các thí nghiệm, tốc độ dòng ảnh hưởng đến thời gian lưu của monotropein. Vì đối tượng nghiên cứu là dược liệu, giá trị thời gian lưu cần lớn hơn 5 phút. Mặt khác về giới hạn độ chính xác khi đo tốc độ dòng của máy HPLC, tốc độ tối thiểu sử dụng cần lớn hơn 0,5 ml/phút (tư vấn của nhà sản xuất). Với tốc độ dòng 0,5 ml/phút cho hình ảnh pic tốt nhất, thời gian lưu hợp lý. Về độ tinh khiết, giá trị tốc độ dòng nhỏ hơn 1 ml/phút khảo sát đều xuất hiện 1 pic phụ theo sau pic chính monotropein mặc dù đạt tiêu chuẩn chất chuẩn với nồng độ lớn hơn 98%.
c) Kết luận
Qua khảo sát và căn cứ vào điều kiện thực nghiệm cho phép chúng tôi quyết định lựa chọn các điều kiện sắc ký như sau:
-Cột: HiQ sil C18HS (250mm x4,6mm, 5µm). -Hệ pha động: MeOH : H2O = 5 : 95. -Bước sóng phát hiện: 237 nm. -Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút. -Thể tích tiêm: 15 µl. -Nhiệt độ phân tích: 25ºC.
-Dung môi pha mẫu: MeOH.
3.4.3.Thẩm định phương pháp định lượng motropein trong ba kích tím Quảng Ninh.
a) Tính đặc hiệu
Tiến hành: Sắc ký đồ mẫu chuẩn monotropein và mẫu thử. Thu được kết quả về SKĐ như sau:
Hình 3.5: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp.
200 300 400 500 600 700 nm 0 50 100 150 200 250 300 350 mAU 3.717/ 1.00 237 389 480