Cân khoảng 20,00 g bột nguyên liệu vào bình nón dung tích 1 L, thêm 500 mL nước hoặc EtOH 96%, đậy kín, tiến hành chiết cafein trong 5 giờ ở nhiệt độ 60°C. Dịch chiết được làm nguội về nhiệt độ phòng, gạn vào bình định mức 1000 mL, pha loãng tới nồng độ thích hợp, lọc qua màng 0,45 µm và phân tích bằng HPLC. Hiệu suất chiết cafein bằng nước hoặc EtOH 96% được so sánh với kết quả chiết cafein bằng sCO2 sử dụng đồng dung môi EtOH 96% ở điều kiện 60°C trong 5 giờ.
18
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Xây dựng quy trình định lượng cafein và EGCG trong lá chè xanh
3.1.1 Kết quả thẩm định phương pháp định lượng cafein và EGCG
Phương pháp HPLC được sử dụng định lượng cafein và EGCG được thẩm định về các tiêu chí:
- Tính đặc hiệu
- Độ thích hợp của hệ thống - Khoảng tuyến tính
3.1.1.1 Tính đặc hiệu
Tiến hành phân tích 5 mẫu: dung dịch mẫu trắng (nước), dung dịch cafein chuẩn, dung dịch EGCG chuẩn, dung dịch hỗn hợp cafein chuẩn và EGCG chuẩn, dung dịch mẫu thử dịch chiết lá chè xanh với chương trình HPLC mục 2.3.1, thu được kết quả đánh giá bằng các sắc ký đồ tương ứng như hình sau:
(a) Mẫu trắng (b) Cafein chuẩn
19 (e) Mẫu thử
Hình 3.1 Sắc ký đồ HPLC thẩm định độ đặc hiệu
Kết quả thu được cho thấy tín hiệu píc của cafein xuất hiện tại thời gian lưu khoảng 21 phút và tín hiệu píc của EGCG xuất hiện tại thời gian lưu khoảng 25 phút. Trên sắc ký đồ mẫu trắng không thấy xuất hiện tín hiệu píc sắc ký tại các thời gian lưu này và trên sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp và mẫu thử có tín hiệu píc của 2 hoạt chất. Như vậy, phương pháp HPLC đã được lựa chọn có tính đặc hiệu phù hợp cho phân tích cafein và EGGC trong lá chè xanh.
3.1.1.2 Độ thích hợp hệ thống
Kết quả được đánh giá thông qua giá trị RSD (%) của diện tích píc và thời gian lưu. Tiêm lặp lại 6 lần một dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ xác định trong khoảng từ 8 đến 200 μg/mL với cafein và từ 12 đến 300 μg/mL với EGCG. Ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích píc.
Bảng 3.1 Kết quả thời gian lưu và diện tích píc của dung dịch chuẩn hỗn hợp
Cafein EGCG Thời gian lưu (phút) Diện tích píc (mAU) Thời gian lưu (phút) Diện tích píc (mAU) 1 21,509 1547008 26,537 4018581 2 20,619 1578919 25,856 4090915 3 21,311 1581128 25,789 4094934 4 20,541 1593511 25,548 3970358
20
5 21,403 1609984 24,978 3989647
6 20,988 1601668 26,001 4131101
Trung bình 21,062 1585370 25,785 4049256
RSD (%) 1,788 1,28 1,996 1,61
Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích píc và thời gian lưu của cafein và EGCG <2%, cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC là phù hợp.
3.1.1.3 Khoảng tuyến tính
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp cafein có nồng độ trong khoảng từ 8 đến 200 μg/mL và EGCG có nồng độ trong khoảng từ 12 đến 300 μg/mL. Tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện ở mục 2.3.1. Kết quả khảo sát sự tương quan giữa diện tích píc và nồng độ cafein và EGCG được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.2 Mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ cafein và EGCG
Cafein EGCG Nồng độ (μg/mL) Diện tích píc (mAU.s) Nồng độ (μg/mL) Diện tích píc (mAU.s) 1 8,08 967556 12,16 696180 2 40,40 4837789 60,80 2741833 3 80,80 9874559 121,60 5744600 4 121,20 13812256 182,40 8170966 5 161,60 18751344 243,20 10645533 6 202,00 23699875 304,00 13480099 Phương trình đường chuẩn y = 115975x +120868 y = 43557x + 204191 R2 0,9991 0,9992
Đường chuẩn được đánh giá thông qua hệ số tương quan R2. Kết quả cho thấy R2 > 0,99, do vậy đường chuẩn được xây dựng có độ tuyến tính cao đảm bảo để thực hiện phép phân tích định lượng cafein và EGCG.
21
Hình 3.2 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ cafein
Hình 3.3 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ EGCG
3.1.2 Khảo sát quy trình chiết định lượng cafein và EGCG trong lá chè xanh
Để xác định hàm lượng cafein và EGCG trong lá chè xanh, cần xây dựng phương pháp chiết kiệt cafein và EGCG trong lá chè. Tiến hành khảo sát một số điều kiện như sau:
3.1.2.1 Khảo sát dung môi chiết
Cafein và EGCG là các hợp chất phân cực, hòa tan tốt trong các dung môi methanol, ethanol, nước và hỗn hợp các dung môi này nên có thể sử dụng chúng
y = 115975x + 120868 R² = 0.9991 0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000 0 50 100 150 200 250 D iện tí ch p íc (m A U .s) Nồng độ (μg/mL) y = 43557x + 204191 R² = 0.9992 0 3000000 6000000 9000000 12000000 15000000 0 50 100 150 200 250 300 350 D iện tí ch p íc (m A U .s) Nồng độ (μg/mL)
22
làm dung môi chiết định lượng cafein và EGCG. Qua việc tham khảo tài liệu về phương pháp định lượng cafein và EGCG trong lá chè xanh, nhận thấy rằng các nghiên cứu thường sử dụng dung môi chiết là nước và dung dịch ethanol. Nghiên cứu tiến hành khảo sát chiết xuất định lượng nguyên liệu với 2 loại đồng dung môi là nước và ethanol 30%.
Tiến hành
- Chiết xuất bằng nước:
Cân chính xác khoảng 200 mg bột lá chè xanh cho vào bình nón dung tích 100 mL, chiết 2 lần × 30 mL nước, giữ nhiệt độ ở 80°C, trong vòng 30 phút. Dịch chiết được để nguội về nhiệt độ phòng và gộp vào bình định mức 100 mL, bổ sung nước cất đến vạch.
- Chiết xuất bằng ethanol 30%:
Cân chính xác khoảng 200 mg bột lá chè xanh cho vào bình nón dung tích 100 mL, chiết 2 lần × 30 mL nước, giữ nhiệt độ ở 50°C, trong vòng 30 phút. Dịch chiết được để nguội về nhiệt độ phòng và gộp vào bình định mức 100 mL, bổ sung nước cất đến vạch.
Phân tích các mẫu bằng HPLC theo mục 2.3.1. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát dung môi chiết xác định hàm lượng cafein và EGCG trong lá chè xanh
Dung môi Hàm lượng cafein
(mg/g) Hàm lượng EGCG (mg/g) Nước 3,87 9,34 Ethanol 30% 4,57 11,27 Nhận xét
Với 2 loại dung môi chiết là nước và ethanol 30% được khảo sát như trên cho thấy chiết bằng dung môi ethanol 30% cho hàm lượng cafein và EGCG cao hơn so với chiết bằng dung môi nước. Như vậy, khi chiết lá chè xanh bằng nước, lượng cafein và EGCG giải phóng thấp, vì vậy nước không phải là dung môi phù
23
hợp để chiết định lượng hoạt chất trong dược liệu. Lựa chọn ethanol 30% là dung môi chiết xuất để xác định hàm lượng cafein và EGCG trong lá chè xanh.
3.1.2.2 Khảo sát số lần chiết
Số lần chiết ảnh hưởng đến hiệu suất chiết nguyên liệu. Nhằm tìm ra phương pháp chiết xuất xác định hàm lượng cafein và EGCG trong lá chè xanh, tiến hành khảo sát số lần chiết xuất nguyên liệu với dung môi ethanol 30%.
Tiến hành
Cân chính xác khoảng 200 mg bột lá chè xanh cho vào bình nón dung tích 100 mL, mỗi lần chiết sử dụng 30 mL ethanol 30%, giữ nhiệt độ ở 50°C, trong vòng 30 phút. Dịch chiết mỗi lần được để nguội về nhiệt độ phòng và gạn vào bình định mức 100 mL, bổ sung nước cất đến vạch.
Phân tích HPLC, xác định hàm lượng cafein và EGCG trong lá chè xanh. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát số lần chiết xác định hàm lượng cafein và EGCG trong lá chè xanh
Lần chiết Hàm lượng cafein (mg/g) Hàm lượng EGCG (mg/g) 1 37,3 111,1 2 8,4 1,7 3 0,7 1,1 Nhận xét
Kết quả cho thấy hàm lượng cafein và EGCG chiết được tại lần thứ 3 nhỏ hơn 2% so với tổng hàm lượng hoạt chất chiết được sau 3 lần. Do vậy, để tiết kiệm thời gian chiết và đảm bảo hoạt chất được chiết kiệt, lựa chọn số lần chiết là 2 lần.
Tóm lại
Điều kiện chiết xác định hàm lượng cafein và EGCG trong lá chè xanh trong đề tài này là:
- Phương pháp ngâm nóng. - Dung môi chiết: ethanol 30%.
24
- Số lần chiết: 2 lần, mỗi lần 30 mL ethanol 30% trong 30 phút ở 50°C. Như vậy, nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu là lá chè xanh có hàm lượng cafein là 45,7 mg/g và hàm lượng EGCG là 112,7 mg/g (tính theo khối lượng dược liệu khô). Hàm lượng này được xem là 100% khối lượng cafein và EGCG chiết được từ mẫu chè trước xử lý với sCO2 để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình loại cafein từ lá chè xanh bằng sCO2.
3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật đến quá trình loại cafein bằng CO2 siêu tới hạn cafein bằng CO2 siêu tới hạn
3.2.1 Lựa chọn đồng dung môi chiết xuất
CO2 chỉ phù hợp để chiết xuất các hợp chất có độ phân cực kém cho đến trung bình, do vậy khi chiết xuất các hoạt chất có tính phân cực cao cần bổ sung thêm một lượng nhỏ đồng dung môi. Do nước, ethanol 96%, isopropanol, ethyl acetat và aceton là những dung môi xanh, không độc hại và có khả năng hòa tan tốt cafein nên đề tài thực hiện nghiên cứu loại cafein bằng sCO2 kết hợp các loại đồng dung môi này.
Tiến hành thí nghiệm với 20 g nguyên liệu kích thước hạt ≤ 1 mm và 10 mL đồng dung môi theo mục 2.3.2 và định lượng mẫu sản phẩm thu được theo mục 2.3.1. Kết quả thu được như bảng sau:
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của đồng dung môi đến hiệu suất chiết cafein và EGCG
Điều kiện chiết xuất Hiệu suất chiết (%) Hệ số
chiết chọn lọc Loại đồng dung môi Áp suất (bar) Nhiệt độ (°C) Thời gian
(giờ) Cafein EGCG
(-) 200 50 3 5,30 2,01 2,64 Nước 200 50 3 20,20 19,60 1,03 EtOH 96% 200 50 3 16,00 10,32 1,55 Isopropanol 200 50 3 12,90 9,10 1,20 Ethyl acetat 200 50 3 10,30 7,00 1,47 Aceton 200 50 3 9,10 6,20 1,47
25
Nhận xét
Hiệu suất chiết cafein khi không có đồng dung môi rất thấp (5,30%) mặc dù hệ số chiết chon lọc cafein/EGCG cao (2,64). Kết quả cho thấy loại đồng dung môi có ảnh hưởng mạnh đến hiệu suất chiết cafein và EGCG cũng như hệ số chiết chọn lọc. Trong đó, hỗn hợp sCO2/nước có hiệu suất chiết cafein và EGCG cao nhất, lần lượt đạt 20,20 và 19,60%. Với các đồng dung môi khác, hiệu suất chiết cafein và EGCG thấp hơn, giảm theo thứ tự đồng dung môi nước > EtOH 96% > isopropanol > ethyl acetat > aceton. Có thể giải thích điều này như sau: Thêm một lượng nhỏ đồng dung môi phân cực vào sCO2 làm tăng độ phân cực, tỷ trọng và khả năng liên kết với phân tử chất tan của hỗn hợp sCO2/đồng dung môi. Trong đó tương tác hydro và Van der Waals là các động lực chủ yếu giúp phân tán phân tử chất tan vào hỗn hợp sCO2/đồng dung môi, tuy nhiên tương tác nào chiếm ưu thế tùy thuộc vào thành phần của hỗn hợp dung môi. Nước và các dung môi phân cực như EtOH 96% dễ dàng tạo liên kết hydro với cafein và EGCG thông qua tương tác giữa nhóm hydroxyl của đồng dung môi với nguyên tử nitơ cũng như các nhóm ceton trong phân tử cafein hay các nhóm phenol của EGCG. Do phân tử EGCG có nhiều nhóm hydroxyl nên liên kết hydro giữa đồng dung môi và EGCG mạnh hơn so với cafein. Mặc dù liên kết hydro cũng có thể xảy ra giữa EtOH và các phân tử chất tan, tuy nhiên không mạnh bằng dung môi nước vì mỗi phân tử EtOH chỉ chứa một nguyên tử hydro mang điện dương đủ cho việc hình thành liên kết, trong khi mỗi phân tử nước có tới hai nguyên tử hydro mang điện dương. Với các alcol phân tử lượng thấp như EtOH, vai trò của nhóm hydroxyl phân cực nổi trội hơn lực tương tác yếu nội phân tử Van der Waals [43]. Ngược lại, lực Van der Waals chiếm ưu thế trong các đồng dung môi ít phân cực hơn nước như EtOH 96%, isopropanol, aceton và ethyl acetat. Độ tan của cafein trong các đồng dung môi này thấp hơn trong nước do sự thiếu hụt các trung tâm tạo liên kết hydro trong phân tử dung môi. Trong đó, EtOH 96% cho hiệu suất chiết cafein cao hơn aceton và ethyl acetat do khả năng tạo liên kết hydro với cafein cao hơn [8]. Isopropanol/sCO2 cho hiệu suất chiết cafein thấp hơn EtOH 96%/sCO2 do
26
isopropanol khan nước nên giảm hình thành liên kết hydro với cafein và ảnh hưởng cản trở do hiệu ứng không gian [25]. Ngoài ra, dược liệu trương nở tốt hơn trong dung môi nước, giúp tăng hiệu suất chiết.
Mặc dù hiệu suất chiết cafein khi sử dụng đồng dung môi là EtOH 96% thấp hơn đồng dung môi nước nhưng hệ số chiết chọn lọc với đồng dung môi EtOH 96% cao hơn nước (1,55 > 1,03). Cân đối giữa các tiêu chí hiệu suất loại cafein, % EGCG được giữ lại và hệ số chiết chọn lọc, EtOH 96% được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo.
3.2.2 Lượng đồng dung môi
Lượng đồng dung môi kết hợp cùng sCO2 ảnh hưởng lớn tới độ phân cực của dung môi chiết xuất. Do vậy, cần khảo sát ảnh hưởng của lượng đồng dung môi EtOH 96% đến quá trình loại cafein bằng sCO2.
Tiến hành thí nghiệm khảo sát lượng đồng dung môi với 20 g nguyên liệu kích thước hạt ≤ 1 mm theo mục 2.3.2 và định lượng mẫu sản phẩm thu được theo mục 2.3.1. Kết quả thu được như bảng sau:
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của lượng đồng dung môi ethanol 96% đến hiệu suất chiết cafein và EGCG
Điều kiện chiết xuất Hiệu suất chiết (%)
Hệ số chiết chọn lọc Lượng đồng dung môi (mL) Áp suất (bar) Nhiệt độ (°C) Thời gian
(giờ) Cafein EGCG
5 200 50 3 11,30 7,00 1,61
10 200 50 3 16,00 10,32 1,55
15 200 50 3 17,80 11,86 1,50
Nhận xét
Tăng lượng đồng dung môi ethanol 96%, hiệu suất chiết cafein và EGCG tăng và đạt giá trị cân bằng ở mức 10 mL đồng dung môi/20 g nguyên liệu. Có thể thấy rằng khi tăng lượng đồng dung môi làm tăng hàm lượng nước trong hỗn hợp sCO2/EtOH 96%, do đó độ phân cực tăng và khả năng trương nở của nguyên
27
liệu tăng. Ngoài ra, nước còn hỗ trợ sự thủy phân phức hợp cafein – tannin trong tế bào, do đó hiệu suất chiết tăng. Tiếp tục tăng lượng EtOH 96% lên 15 mL, hiệu suất chiết cafein tăng không đáng kể, trong khi hiệu suất chiết EGCG tăng làm hệ số chiết chọn lọc giảm. Do đó, thể tích đồng dung môi được cố định là 10 mL tương ứng với 20 g bột dược liệu.
3.2.3 Kích thước nguyên liệu
Kích thước nguyên liệu là một yếu tố quan trọng trong quá trình chiết xuất, vì nó có thể ảnh hưởng đến sự chuyển khối của chất tan và dung môi, và cũng có thể liên quan trực tiếp đến tổng diện tích bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi. Nhằm đánh giá sự ảnh hưởng của kích thước đến quá trình loại cafein bằng sCO2, khảo sát chiết xuất với 2 mẫu nguyên liệu: kích thước ≤ 1 mm và kích thước 1 – 2 mm.
Thực hiện chiết xuất bằng sCO2 theo mục 2.3.2 và xử lý theo mục 2.3.1, kết quả thu được như sau:
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất chiết cafein và EGCG
Điều kiện chiết xuất Hiệu suất chiết (%) Hệ số
chiết chọn lọc Kích thước Áp suất (bar) Nhiệt độ (°C) Thời gian
(giờ) Cafein EGCG
≤ 1 mm 200 50 3 16,00 10,32 1,55
1 – 2 mm 200 50 3 14,89 8,67 1,72
Nhận xét
Khi sử dụng bột có kích thước lớn (1 – 2 mm), hệ số chiết chọn lọc lớn hơn nhưng hiệu suất chiết cafein nhỏ hơn so với khi sử dụng bột có kích thước nhỏ (≤1 mm). Việc tăng hiệu suất chiết cafein và EGCG từ lá chè xanh với kích thước nguyên liệu nhỏ hơn cũng được ghi nhận trong nghiên cứu của Park (năm 2007) [36] và có thể được giải thích bằng quá trình khuếch tán chất tan trong nguyên liệu. Khi kích thước hạt tăng lên, khoảng cách mà chất tan phải đi từ bên trong nguyên liệu đến bề mặt cũng tăng lên, dẫn đến quá trình chiết chất tan càng chậm.