Các khảo sát để lựa chọn phương pháp làm giảm KTTP được tiến hành trên các mẫu có tổng nồng độ lipid là 30mM, 5% mol DSPE-PEG 2000 trong môi trường hydrat hoá là mannitol 5%, HEPES 10mM. Các hỗn dịch thô của liposome được chuẩn bị như mô tả ở mục 2.3.2. Các nghiên cứu liên quan đến màng kép HSPC cho thấy nhiệt chuyển pha của các hệ không phải là một điểm mà là một khoảng nhiệt độ, kéo dài từ khoảng 52 đến 58oC. Do vậy, giai đoạn làm giảm KTTP được tiến hành ở nhiệt độ lớn hơn khoảng nhiệt độ nói trên với tất cả các phương pháp làm nhỏ KTTP được khảo sát (≥ 70oC). Kết quả khảo sát và lựa chọn phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân phù hợp được trình bày dưới đây:
Máy đồng nhất hóa áp suất cao EmulsiFlex – c5 (Avestin – Canada): Kết quả khảo sát cho thấy thiết bị đồng nhất áp suất cao có khả năng tạo ra kích thước nano đồng đều. Tuy vậy, việc bào chế các hệ liposome có kích thước micro (5-15µm) ở vùng kích thước micro gặp nhiều khó khăn, KTTP có độ lặp lại kém giữa các lần thí nghiệm. Hơn nữa do thể tích buồng nén của máy lớn, lượng mẫu cần sử dụng và lượng mẫu hư hao lớn sau các chu kỳ có thể làm thay đổi nồng độ liposome trong các mẫu ban đầu.
Hệ thống đùn nén mini-extruder ER1 (Eastern Scientific LLC-USP): khả năng làm giảm KTTP liposome bằng phương pháp đùn được khảo sát với mẫu liposome 5% mol DSPE-PEG 2000 ở nồng độ 30mM trong mannitol 5%. Kết quả kháo sát cho thấy phương pháp đùn không giúp làm giảm KTTP hay làm KTTP đồng đều hơn. Cụ thể, hỗn dịch thô liposome không thể đùn được qua màng nếu chưa làm giảm KTTP sơ bộ bằng các phương pháp khác. Không những vậy, khi tiến hành đùn các mẫu liposome nói trên nhưng đã được làm giảm kích thước sơ bộ (sử dụng thiết bị siêu âm đầu dò tới khi KTTP nằm trong khoảng 100 - 200nm, PDI > 0,3) qua màng polycarbonat 200nm và 100nm ở nhiệt độ 75-80℃, hỗn dịch liposome qua được màng 200 nm nhưng dễ rách màng sau 3 – 4 lần đùn và không qua được màng 100 nm. Mặt khác, ở nhiệt độ 75-80oC nước bay hơi
20
nhanh và thể tích của tất cả các mẫu bị giảm đáng kể sau quá trình đùn. Bên cạnh đó, PL cũng có thể bị giữ lại ở màng polycarbonat, do vậy dù có điều chỉnh thể tích, nồng độ lipid cũng sẽ không chính xác như ban đầu. Do vậy, việc sử dụng các hệ này để bào chế gel và đánh giá lưu biến là không phù hợp vì sẽ gây sai số do tổng nồng độ lipid là một yếu tố quan trọng nhất quyết định tới đặc tính lưu biến của hệ.
Siêu âm với thiết bị đầu dò Ultrasonic Homogenizer (QSONICA – Mỹ): Các khảo sát với máy siêu âm đầu dò được tiến hành với các mẫu liposome có thành phần tương tự như các phương pháp trên với các thời gian siêu âm khác nhau ở cường độ (amplitude) tối thiểu của thiết bị là 20%. Kết quả cho thấy, khi sử dụng máy siêu âm đầu dò với thời gian siêu âm liên tục khoảng 7 phút, KTTP thu được khoảng 150 nm nhưng mẫu bị đa phân tán PDI > 0,3. Ở thời gian siêu âm 3 phút, liposome đo được dao động trong khoảng từ 5 – 10 µm và có giá trị span > 3, đồ thị phân bố kích thước có nhiều pic, cho thấy mẫu bị đa phân tán. Các thí nghiệm sử dụng chế độ siêu âm ngắt quãng và khuấy trộn trong quá trình siêu âm không giúp cải thiện tình trạng đa phân tán của các mẫu liposome bào chế được. Bên cạnh đó, các mẫu sau siêu âm chứa tạp đen, có thể là do titan nhiễm từ đầu dò. Do vậy, các hệ liposome bào chế bằng siêu âm đầu dò cũng không phù hợp.
Siêu âm bể: Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp siêu âm bể có nhiều ưu điểm và phù hợp để thu được các hệ liposome phục vụ cho các mục tiêu của đề tài. Cách tiến hành cụ thể như sau: Các lọ chứa hỗn dịch liposome thô thu được như mô tả ở mục 2.3.2 được siêu âm bể với các khoảng thời gian khác nhau, nhiệt độ nước trong bể duy trì trong khoảng 65-70℃, mực nước trong bể siêu âm cao hơn mực nước trong các lọ khoảng 3 – 5 mm. Tỷ lệ các thành phần và KTTP của các hệ thu được được trình bày cụ thể trong bảng 3.1.
21
Bảng 3.1 KTTP thu được sau siêu âm bể của các công thức, môi trường hydrat hóa khác nhau: mannitol 5%, HEPES 10mM (HEPES/Man); glucose 5%, HEPES 10mM
((HEPES/Glu) và đệm phosphat salin (PBS).
Tên mẫu Tổng nồng độ lipid (mM) Tỷ lệ mol DSPE – PEG 2000 (%) Môi trường hydrat hoá Thời gian siêu âm cần thiết (phút) D4.3 (µm) D50 (µm) D90 (µm) Span 1 50 0 HEPES/Man 70 7,77 6,86 13,4 1,425 2 50 1 HEPES/Man 35 15,8 13,9 28,5 1,613 3 50 5 HEPES/Man 35 15,0 12,9 25,3 1,650 4 50 5 HEPES/Glu 35 15,0 13,0 27,5 1,689 5 50 5 PBS 35 26,3 19,4 54,0 2,374 6 50 5 HEPES/Man 50 7,23 5,89 10,9 1,392 7 50 5 HEPES/ Glu 50 7,67 6,68 10,7 1,415 8 50 5 PBS 50 15,2 13,4 27,0 1,553 9 100 5 HEPES/Man 90 7,67 6,47 14,1 1,684 10 50 1 HEPES/Man 70 KTTP : 137 nm, PDI : 0,241 11 50 5 HEPES/Man 70 KTTP : 134 nm, PDI : 0,234 Nhận xét:
Siêu âm bể có nhiều ưu điểm hơn hẳn các biện pháp giảm KTTP khác đã khảo sát:
Khối lượng và thể tích mẫu hầu như không thay đổi trong quá trình siêu âm, tổng nồng độ lipid không thay đổi so với ban đầu do tránh được việc phải chuyển mẫu qua nhiều loại dụng cụ khác nhau.
KTTP phụ thuộc vào thời gian siêu âm nhưng không bị thay đổi quá nhanh trong thời gian ngắn, giúp thu được các vùng kích thước khác nhau.
22
Có thể thu được KTTP ở các vùng kích thước khác nhau và các nồng độ khác nhau, KTTP của liposome thu được bằng siêu âm bể ít bị đa phân tán hơn so với siêu âm đầu dò. Mặc dù giá trị PDI của các hệ nano còn tương đối lớn nhưng vẫn < 0,25, vẫn phù hợp để sử dụng trong các thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của KTTP lên đặc tính lưu biến của HA.
Lượng nguyên liệu cần sử dụng cho mỗi công thức nhỏ, phù hợp với giai đoạn khảo sát, nghiên cứu tiền công thức. Bên cạnh đó, nồng độ lipid cao trong các mẫu (có thể lên tới 50 - 100mM) có thể sẽ giúp làm giảm hư hao dược chất trong các thí nghiệm sau này, đặc biệt là khi dược chất được đưa vào pha nước.
Sự có mặt của DSPE-PEG 2000 có ảnh hưởng đáng kể tới KTTP. Cụ thể, để giảm KTTP tới khoảng 7 µm, mẫu không chứa DSPE-PEG 2000 cần 70 phút trong khi mẫu chứa DSPE-PEG 2000 chỉ cần khoảng 50 phút. Tuy vậy, không có sự khác biệt đáng kể về KTTP giữa các mẫu chứa 1 và 5% DSPE-PEG 2000.
Do các ưu điểm nêu trên, phương pháp siêu âm bể được sử dụng để bào chế các mẫu liposome để tiến hành các khảo sát tiếp theo của đề tài.