Phương pháp định lượng Stipuleanosid R2 bằng HPLC- 123docz.net

2. CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.3. Phương pháp định lượng Stipuleanosid R2 bằng HPLC

Tham khảo phương pháp nghiên cứu trong đề tài “Nghiên cứu thành phần saponin của thân rễ SVD” - luận văn thạc sĩ của Nguyễn Thị Thu Thủy [12] và các nghiên cứu về định lượng Stipuleanosid R2 trước đó [8] chúng tôi tiến hành lựa chọn phương pháp HPLC như sau

2.2.3.1.Phương pháp HPLC

 Chuẩn bị mẫu

Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 1,0 mg hợp chất stipuleanosid R2, pha thành dung dịch gốc nồng độ 1000 µg/ml với MeOH, siêu âm 10 phút, ly tâm lấy dịch chiết rồi lọc qua màng lọc kích thước 0,45µm thu được dung dịch để triển khai sắc ký.

Mẫu thử:cân chính xác khoảng 0,1g cao tổng thân rễ; 0,5g cao tổng thân và lá SVD (độ ẩm 7,8 %) cho vào bình định mức 10ml, thêm 7ml MeOH sau đó lắc siêu âm 10 phút để hòa tan. Các dung dịch được lọc qua màng lọc kích thước 0,45µm thu được dung dịch để triển khai sắc ký.

Mẫu trắng:dung dịch MeOH.  Điều kiện sắc ký

 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity.

 Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm).  Detector DAD phát hiện ở bước sóng 203nm.

 Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.  Thể thích bơm mẫu: 20µl.  Nhiệt độ: 25℃.

 Pha động: Acetonitril (kênh A) - 0,5% Acid acetic/H2O (kênh B) với chương trình gradient nhưBảng 2.1.

Bảng 2.1.Chương trình dung môi chạy HPLC-DAD

Thời gian (phút) Acetonitril (%) Acid acetic 0,5% (%) 0-5 20 80 25-15 20→40 80→60 15-20 40 60 20-30 40→100 60→0 30-35 100 0 35-40 100→20 0→80 40-45 20 80

Mục tiêu: phương pháp phân tích được xây dựng nhằm mục đích định tính và định lượng thành phần Stipuleanosid R2 trong các bộ phận khác nhau của SVD.

Nguyên tắc: sử dụng chất chuẩn liên kết Stipuleanosid R2 để xây dựng đường chuẩn.

2.2.3.2.Kết quả thẩm định phương pháp phân tích

a) Tính đặc hiệu

Tiến hành sắc ký các loại mẫu trắng, mẫu chuẩn stipuleanosid R2 và mẫu thử theo quy trình phân tích ở trên. Ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu và phổ UV của pic stipuleanosid R2 trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn. Kết quả thu được được trình bày trong các hình sau.

Hình 3.1.Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử

Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của dung môi pha mẫu không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của stipuleanosid R2 trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Sắc ký đồ của dung dịch thử cho 1 pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của stipuleanosid R2 trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn.

b) Tính thích hợp hệ thống

Tiến hành phân tích 01 dung dịch chuẩn của stipuleanosid R2 lặp lại 06 lần. Tiến hành sắc ký, ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic, hệ số đối xứng. Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu, diện tích pic và hệ số bất đối lần lượt là 0,15%; 2,75% và 1,21% đều thấp hơn 3%

(Bảng 3.3). Điều đó cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống sắc ký HPLC sử dụng là ổn định, phù hợp cho phép phân tích stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp.

Bảng 3.3. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký STT Thời gian lưu

(phút) Diện tích pic (mAU*s) Hệ số bất đối 1 15,707 424,728 0,90 2 15,698 421,771 0,89 3 15,674 449,195 0,92 4 15,658 419,380 0,90

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 5 15,680 418,038 0,92 6 15,729 440,903 0,91 TB 15,691 429,003 0,913 RSD (%) 0,15 2,75 1,21 c) Độ tuyến tính

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn bằng cách pha loãng từ một dung dịch chuẩn gốc ban đầu với các hệ số pha loãng khác nhau. Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch tiêm 3 lần) ghi lại sắc ký đồ và xác định đáp ứng của pic. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn trong mẫu so và đáp ứng pic thu được trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu. Kết quả cho thấy tương quan tuyến tính giữa diện tích pic trên sắc ký đồ và nồng độ stipuleanosid R2 trong dung dịch theo phương trình

y = 2,6081x + 49,1185 với hệ số tương quan R2 = 0,9988 (Bảng 3.4.và Hình 3.4.). Trong khoảng nồng độ khảo sát 15,625 – 400 µg/ml có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ stipuleanosid R2 với hệ số tương quan rất cao.

Bảng 3.4Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid R2 STT Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (mAU*s)

1 15,625 90,65283 2 37,5 154,6339 3 75 239,247 4 150 418,038 5 200 589,441 6 300 836,676 7 400 1087,77

Hình 3.2.Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2 d) Giới hạn phát hiệu (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có giới hạn phát hiện là LOD = 1,953 µg/ml, giới hạn định lượng LOQ = 3,3 x LOD = 6,445 µg/ml.

Kết quả cho thấy phương pháp đã xây dựng có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng tương đối phù hợp để xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong Sâm Vũ Diệp.

e) Độ lặp lại

Tiến hành định lượng 6 mẫu thử độc lập, mỗi mẫu tiêm 3 lần. Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong mẫu các mẫu thử bằng cách sử dụng đường chuẩn ở phần xác định khoảng tuyến tính. Đô lặp lại của phương pháp được xác định bằng giá trị RSD (%), kết quả định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 trong mẫu. Độ lệch chuẩn tương đối RSD < 3%. Như vậy, phương pháp có độ lặp lại tốt và có thể ứng dụng trong phân tích stipuleanoside R2 (PBF41) trong sâm vũ diệp (Bảng 3.5.).

Bảng 3.5.Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp Thí nghiệm Khối lượng (g) Nồng độ cao (mg/ml) Diện tích pic (mAU*s) Hàm lượng (%) 1 0,0968 100 6372,05 2,42 2 0,0921 100 6761,73 2,57 3 0,1308 100 6619,42 2,52

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4 0,2297 200 12960,5 2,48 5 0,2064 200 12671,5 2,42 6 0,2059 200 12837,4 2,45 Trung bình 2,477 RSD (%) 2,20 f) Độ đúng

Khi thêm các lượng stipuleanosid R2 chuẩn khác nhau, phương pháp đều cho độ thu hồi nằm trong khoảng và độ lệch chuẩn tương đối RSD. Kết quả này chứng tỏ phương pháp xây dựng có độ thu hồi tốt, phù hợp với định lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp. Kết quả được trình bày ởBảng 3.6.

Bảng 3.6.Khảo sát độ thu hồi

STT Lượng có sẵn (µg) Lượng thêm vào (µg) Diện tích pic (mAU*s) Lượng tìm lại (µg) Độ thu hồi (%) 1 711,754 75 2094,160 72,358 96,48 2 711,754 75 2093,725 72,191 103,68 3 711,754 100 2167,998 100,668 100,67 4 711,754 100 2175,860 103,683 96,25 5 711,754 200 2416,990 196,137 98,07 6 711,754 200 2451,260 209,277 104,64 Trung bình 99,96 RSD (%) 3,31

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU Tiêm riêng biệt các dung dịch mẫu thử, mỗi mẫu thử lặp lại 3 lần, ghi nhận sắc ký đồ và ghi lại đáp ứng của chất cần phân tích.

Nồng độ của stipuleanosid R2 trong dung dịch thử được xác định dựa trên công thức: C (µg/ml) = S-b x H a 100

Với S là diện tích pic stipuleanosid R2; a,b là các hệ số của phương trình đường chuẩn y = ax+b, H là độ tinh khiết của chất đối chiếu (%).

Hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu được xác định dựa trên công thức:

Trong đó:

M: khối lượng dược liệu (g).

X: hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu (%).

C: Nồng độ stipuleanosid R2 trong dung dịch thử, xác định được bằng đường chuẩn (µg/ml).

a: độ ẩm của dược liệu (%). H: hiệu suất chiết (%).  Xử lý số liệu

+ Tập hợp kết quả và loại bỏ giá trị thô theo test Dixon. + Tính giá trị trung bình:

+ Tính độ lệch chuẩn:

X (%) = C x 10 x 100 x 100 x H m x 1000000 100-a

Trong đó:

X: giá trị trung bình của hàm lượng hợp chất chính. xi: giá trị của hàm lượng hợp chất chính của mẫu thứ i.

n : số thử nghiệm được sử dụng để tính giá trị trung bình về hàm lượng của hợp chất chính.

SD: độ lệch chuẩn.