phổ hấp thụ tử ngoại.
2.3.3.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn
Hòa tan 30mg chất đối chiếu THSG vào chính xác 2ml EtOAc thu được dung dịch chuẩn nồng độ Co = 15mg/ml.
2.3.3.2. Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của THSG
Quét phổ UV chuẩn THSG/EtOAc (nồng độ 0,3mg/ml), mẫu trắng là EtOAc để xác định bước sóng cực đại.
2.3.3.3. Triển khai sắc ký lớp mỏng
- Hệ dung môi: toluen: EtOHtđ: acid aceticbăng (8: 2: 0,5).
- Dung dịch thử:
• Dược liệu hà thủ ô đỏ chế: cân chính xác khoảng 10g bột dược liệu, chiết 2 lần bằng EtOH 50%, mỗi lần 20ml dung môi, siêu âm 30 phút, lọc qua màng
21
cellulose, cô cách thủy còn khoảng 10ml sau đó chiết lỏng – lỏng với EtOAc 2 lần, mỗi lần 10ml, gạn lấy lớp EtOAc, cô đến còn khoảng 4ml thì cho dịch chiết vào bình định mức 5ml, bổ sung EtOAc đến vạch, lắc đều, đem dịch chấm sắc ký.
• Cao lỏng hà thủ ô đỏ chế: Lấy chính xác 10ml cao lỏng cho vào bình gạn, chiết lỏng – lỏng với EtOAc 2 lần, mỗi lần 10ml, gạn lấy lớp EtOAc, cô đến còn khoảng 4ml thì cho dịch chiết vào bình định mức 5ml, bổ sung EtOAc đến vạch, lắc đều, đem dịch chấm sắc ký.
- Mẫu trắng: EtOAc.
- Bản mỏng Silicagel F254 (20cm x 10cm) hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ được chia thành 9 băng. Chấm lần lượt mỗi băng theo bảng 2.1, chấm thành vạch dài 15mm. Bảng 2.1. Thể tích chấm định lượng Mẫu Vc (μl) Trắng 100 Chuẩn 1 60 Chuẩn 2 80 Chuẩn 3 100 Chuẩn 4 120 Chuẩn 5 140 Cao cồn 50% 100 Cao nước 100 Hà thủ ô đỏ chế 100
Tiến hành sắc ký, khi dung môi đi được 8cm thì lấy bản mỏng ra, để khô ngoài không khí 1 giờ, quan sát dưới đèn UV 366nm, vạch đường ngang phía trên và phía dưới để xác định các vết THSG. Cạo riêng biệt các vùng có vết THSG của mẫu chuẩn và mẫu thử, cạo vùng thẳng hàng với vết THSG của mẫu trắng để làm mẫu trắng, cho mỗi mẫu bột silicagel vào lọ thủy tinh dung tích 20ml.
22
2.3.3.4. Đo quang phổ hấp thụ tử ngoại
- Chuẩn bị mẫu đo quang: thêm vào mỗi mẫu bột silicagel cạo được 5ml EtOAc, siêu âm 30 phút, đun cách thủy ở 45oC trong 30 phút, lấy ra để nguội. Lọc lấy dịch lọc trong cho vào bình định mức 5ml, tráng lọ bằng EtOAc, bổ sung EtOAc vừa đủ 5ml.
- Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn và thử so với mẫu trắng ở bước
sóng cực đại xác định được. Kết quả đo của mỗi dung dịch chuẩn và dung dịch thử là giá trị trung bình của 5 lần đo nhắc lại.
2.3.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
- Một số đặc trưng thống kê: các đặc trưng thống kê được tính dựa vào các hàm số trong Microsoft Excel.
• Giá trị trung bình TB: Hàm AVERAGE.
• Độ lệch chuẩn SD: Hàm STDEV.
• Độ lệch chuẩn tương đối: RSD% = SD
TB * 100.
- Xây dựng đường chuẩn bằng Excel, suy ra nồng độ THSG trong dung dịch
thử. Từ đó tính hàm lượng THSG trong mẫu hà thủ ô đỏ chế, cao cồn 50%, cao nước theo công thức:
• Lượng THSG trong mẫu thử:
mTHSG = Cđ∗5∗V
Vc
Trong đó: mTHSG: lượng THSG trong mẫu thử (mg).
Cđ: nồng độ THSG tính theo đường chuẩn (mg/ml). Vc: thể tích chấm (ml).
V: thể tích dung dịch EtOAc (V = 5ml).
• Hàm lượng THSG trong hà thủ ô đỏ chế:
HL% = mTHSG
m ∗ (1 − h)∗ 100 Trong đó: HL%: hàm lượng THSG trong mẫu hà thủ ô đỏ chế.
23 m: khối lượng hà thủ ô đỏ chế (g). h: hàm ẩm của DL hà thủ ô đỏ chế (%).
• Hàm lượng THSG trong mẫu cao lỏng:
HL% = mTHSG
VC ∗ ⅆ ∗ 100 Trong đó: HL%: hàm lượng THSG trong mẫu cao lỏng.
mTHSG: lượng THSG trong mẫu (g). Vc: thể tích cao định lượng (Vc = 10ml). d: tỉ trọng của cao lỏng HTÔĐC (g/ml).
24
CHƯƠNG 3.THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Điều chế cao lỏng hà thủ ô đỏ chế
- Thực hiện điều chế cao lỏng theo mục 2.3.2, kết quả thu được 150ml cao lỏng chiết cồn 50% và 150ml cao lỏng chiết nước.
Bảng 3.1. Cảm quan cao lỏng HTÔĐC
Tiêu chí Cao cồn 50% Cao nước
Thể chất Chất lỏng sánh, đồng nhất Chất lỏng sánh, đồng nhất
Màu sắc Màu nâu đậm Màu nâu nhạt hơn
Mùi Có mùi thơm của Hà thủ ô Mùi thơm hơn
Vị Đắng, hơi chát Đắng, hơi chát
Nhận xét: Các tiêu chí về cảm quan của 2 mẫu cao lỏng tương đương nhau. - Xác định tỉ trọng cao lỏng:
Bảng 3.2. Tỉ trọng của các mẫu cao lỏng
Lần đo Cao cồn 50% Cao nước
mb (g) mbc (g) mb (g) mbc (g) 1 12,4393 17,4779 7,4534 12,6519 2 12,4394 17,4778 7,4533 12,6520 3 12,4393 17,4788 7,4533 12,6520 Trung bình 12,4393 17,4782 7,4533 12,6520 d (g/ml) 1,0078 1,0397
Nhận xét: Cao cồn 50% của hà thủ ô đỏ chế có tỉ trọng thấp hơn tỉ trọng của cao nước.
3.2. Định tính một số nhóm hoạt chất trong cao lỏng hà thủ ô đỏ chế
3.2.1. Định tính bằng phản ứng hóa học
Bảng 3.3. Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học của cao lỏng HTÔĐC
Hoạt chất Phản ứng Cao cồn
50% Cao nước
25 Phản ứng với TT Dragendorff ̶ ̶ Phản ứng với TT Bouchardat ̶ ̶ Anthraquinon Phản ứng Borntraeger + + Flavonoid Phản ứng Cyanidin + + Phản ứng NaOH 10 % + + Phản ứng với NH3 + + Phản ứng với DD FeCl3 5% + +
Tanin Phản ứng với DD FeCl3 5% + +
Phản ứng với chì acetat 10% + +
Saponin Phản ứng tạo bọt ̶ ̶
Coumarin
Phản ứng mở - đóng vòng lacton ̶ ̶
Quan sát huỳnh quang ̶ ̶
Phản ứng với TT diazo ̶ ̶
Acid amin TT ninhydrin 3% ̶ ̶
Chú thích: + : phản ứng xảy ra, ̶ : phản ứng không xảy ra.
Nhận xét: Cao cồn 50% và cao nước của hà thủ ô đỏ chế đều cho phản ứng dương tính với NaOH 10%, NH3, FeCl3 5%, chì acetat 10%, phản ứng Borntraeger và Cyanidin; phản ứng âm tính với các thuốc thử còn lại.
Từ đó, kết luận sơ bộ cao cồn 50% và cao nước của hà thủ ô đỏ chế có chứa anthraquinon, flavonoid và tanin.
3.2.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
- Để khảo sát hệ dung môi pha động, chúng tôi tiến hành SKLM mẫu thử
dược liệu chế, cao cồn 50%; mẫu đối chiếu emodin, physcion, THSG thu được kết quả như sau:
26
Hình 3.1. Sắc ký đồ hệ (1), (2), (3), (4) (366nm)
Nhận xét: Sắc ký đồ của 4 hệ cho thấy hệ (1) không tách được THSG; hệ (2) không tách được nhiều vết, Rf của emodin và physcion gần bằng nhau; hệ (4) cho nhiều vết hơn hệ (1), (2) nhưng Rf của vết THSG tương đối thấp; hệ (3) cho nhiều vết nhất, các vết tách rõ nét nhất trong 4 hệ. Do vậy, chúng tôi lựa chọn hệ (3) là hệ dung môi pha động cho sắc ký lớp mỏng.
- Tiến hành định tính SKLM các mẫu thử chiết bằng EtOAc, MeOH và mẫu
chuẩn emodin, physcion, THSG với hệ (3), sắc ký đồ trên hình 3.3.
27
Chú thích: 1 – 4: Mẫu chiết bằng EtOAc (1: DLS, 2: DLC, 3: cao cồn 50%, 4:
cao nước); 5: emodin; 6: physcion; 7: THSG; 8 – 11: Mẫu chiết bằng MeOH (8: DLS, 9: DLC, 10: cao cồn 50%, 11: cao nước).
Nhận xét: Trên sắc ký đồ, mẫu đối chiếu emodin (5), physcion (6), THSG (7) đều cho một vết rõ nét, không có vết lạ. Dưới đèn tử ngoại 366nm, emodin có màu vàng đậm, physcion có màu vàng nhạt, THSG có màu xanh dương. Các mẫu thử 1 – 4 đều cho các vết emodin, physcion, THSG có màu sắc và Rf tương đương với các mẫu chuẩn; trong đó, mẫu 2 và 3 cho vết rõ nét hơn mẫu 1 và 4. Các mẫu thử 8 – 11 cho vết THSG rõ ràng, vết emodin không hiện rõ. Mẫu 8, 9 phát hiện vết có Rf tương đương với mẫu đối chiếu physcion còn mẫu 10, 11 không hiện rõ vết có Rf tương đương với mẫu đối chiếu physcion.
So sánh sắc ký đồ của các mẫu chiết bằng EtOAc với sắc ký đồ của các mẫu chiết bằng MeOH chúng tôi thấy sắc ký đồ của mẫu chiết bằng EtOAC cho nhiều vết rõ nét hơn các mẫu chiết bằng MeOH; các vết emodin, physcion, THSG trên sắc ký đồ của các mẫu chiết bằng EtOAc đều hiện rõ ràng còn các mẫu chiết bằng MeOH hiện rõ vết THSG và physcion, không hiện rõ emodin. So sánh sắc ký đồ của mẫu cao cồn 50% với sắc ký đồ của mẫu cao nước khi chiết lại bằng EtOAc và MeOH, chúng tôi thấy các vết emodin, physcion, THSG trong sắc ký đồ của cao cồn 50% đều đậm màu hơn các vết trong sắc ký đồ của cao nước. Như vậy, phương pháp ngâm chiết được nhiều hoạt chất hơn phương pháp sắc nước truyền thống.
3.3. Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của THSG.
28
Hình 3.3. Phổ UV và các cực đại hấp thụ của THSG
Chú thích: A: Phổ UV của THSG, B: Các bước sóng hấp thụ cực đại của THSG.
Nhận xét: phổ UV của THSG cho thấy đỉnh hấp thụ cực đại tại các bước sóng 211, 223, 242, 319 nm.
Qua tham khảo các nghiên cứu trước đây [10], [22] trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn bước sóng 319 nm để định lượng THSG.
3.4. Thẩm định phương pháp định lượng
3.4.1. Khảo sát độ thích hợp hệ thống
Tiến hành chấm lặp lại 6 lần mẫu chuẩn THSG đã chuẩn bị ở mục 2.3.5.1, thể tích chấm 100 µl, ghi lại giá trị Rf. Kết quả như sau:
29
Chú thích: 1 – 6: mẫu chuẩn THSG
Nhận xét: các vết THSG chuẩn trên sắc ký đồ có màu sắc rõ nét, không có vết lạ, giá trị Rf lặp lại cao cho thấy điều kiện sắc ký lựa chọn phù hợp và đảm bảo độ ổn định của phép phân tích định lượng.
3.4.2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của THSG
- Triển khai sắc ký lớp mỏng theo mục 2.3.5.2, kết quả thu được như hình 3.6.
Hình 3.5. Sắc ký đồ định lượng THSG (366nm)
Chú thích: TRANG: mẫu trắng, CHUAN 1: mẫu chuẩn 1, CHUAN 2: mẫu
chuẩn 2, CHUAN 3: mẫu chuẩn 3, CHUAN 4: mẫu chuẩn 4, CHUAN 5: mẫu chuẩn 5, CAO CON: mẫu cao cồn 50%, CAO NUOC: mẫu cao nước, HTODC: mẫu hà thủ ô đỏ chế.
Nhận xét: Trên sắc ký đồ, mẫu trắng và mẫu chuẩn không có vết lạ; vết THSG có màu xanh dương khi quan sát dưới đèn UV 366nm; các mẫu thử cao cồn 50%, cao nước, DL hà thủ ô đỏ chế cho vết tách rõ ràng, có vết tương ứng với mẫu chuẩn về màu sắc và Rf.
30
Bảng 3.4. Độ hấp thụ UV của mẫu THSG chuẩn ở bước sóng 319nm
Mẫu Chuẩn 1 Chuẩn 2 Chuẩn 3 Chuẩn 4 Chuẩn 5
Vc (µl) 60 80 100 120 140 mc (mg) 1,008 1,344 1,680 2,016 2,352 Cđ (mg/ml) 0,2016 0,2688 0,336 0,4032 0,4704 A L1 0,183 0,232 0,276 0,393 0,443 L2 0,185 0,232 0,278 0,394 0,443 L3 0,184 0,234 0,279 0,391 0,446 L4 0,186 0,235 0,279 0,391 0,446 L5 0,186 0,235 0,279 0,390 0,452 TB 0,1848 0,2336 0,2782 0,3918 0,446 SD 0,0013 0,0015 0,0013 0,0016 0,0037 RSD% 0,71 0,65 0,47 0,42 0,82 Chú thích: Vc: thể tích chấm định lượng (µl).
mc: lượng THSG tương ứng thể tích chấm mc = Co∗Vc
1000 (mg). Cđ: nồng độ THSG đo độ hấp thụ, Cđ = mc/5(mg/ml).
Nhận xét: Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của độ hấp thụ A của mỗi mẫu chuẩn THSG đều nhỏ hơn 5,0% [13], độ hấp thụ A trung bình tăng dần theo thể tích chấm mẫu.
31
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ THSG và độ hấp thụ
Nhận xét: đường chuẩn được đánh giá thông qua hệ số tương quan R. Kết quả đánh giá đường chuẩn của THSG là R = 0,986 (R2 = 0,9719) cho thấy đường chuẩn xây dựng có độ tuyến tính cao, đảm bảo thực hiện phép phân tích định lượng THSG.
Phương trình đường chuẩn y = 1,0128x – 0,0334. Trong đó: y: độ hấp thụ, x: nồng độ THSG (mg/ml).
3.5. Kết quả định lượng THSG trong mẫu dược liệu và mẫu cao lỏng hà thủ ô đỏ chế ô đỏ chế
Áp dụng phương pháp đã xây dựng, tiến hành đánh giá hàm lượng THSG trong DL hà thủ ô đỏ chế và cao lỏng hà thủ ô chế. Kết quả định lượng THSG trong các mẫu thử được trình bày trong bảng 3.7:
Bảng 3.5. Kết quả định lượng THSG trong các mẫu thử
Mẫu thử DL hà thủ ô đỏ
chế Cao cồn 50% Cao nước
A Lần 1 0,257 0,407 0,125 Lần 2 0,257 0,407 0,122 y = 1.0128x - 0.0334 R² = 0.9719 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 Độ hấp thụ A Nồng độ Cđ (mg/ml) Đường chuẩn của THSG
32 Lần 3 0,259 0,409 0,122 Lần 4 0,259 0,409 0,110 Lần 5 0,259 0,409 0,110 TB 0,2582 0,4082 0,1178 Cđ (mg/ml) 0,2879 0,4360 0,1493 mTHSG (mg) 71,9787 109,0047 37,3223 HL% 0,79 1,08 0,36 Chú thích: A: độ hấp thụ quang Cđ: nồng độ THSG trong mẫu thử Cđ = 𝐴+0,0334 1,0128 (mg/ml)
mTHSG: lượng THSG trong mẫu thử (mg). HL%: Hàm lượng THSG trong mẫu thử.
Nhận xét: Lượng THSG trong các mẫu thử định lượng được khá cao: lượng THSG trong Hà thủ ô đỏ chế trên 70mg, lượng THSG trong cao chiết cồn 50% trên 100mg, lượng THSG trong cao chiết nước gần 40mg. Hàm lượng THSG trong mẫu Hà thủ ô đỏ sau chế biến là 0,79% thấp hơn hàm lượng THSG trong mẫu cao cồn 50% (1,08%) và cao hơn hàm lượng THSG trong mẫu cao nước (0,36%). Mẫu cao cồn 50% cho hàm lượng THSG cao hơn mẫu cao nước và mẫu dược liệu.
33
BÀN LUẬN
- Về điều chế cao lỏng, phương pháp chiết xuất là ngâm lạnh, đây là phương pháp đơn giản, thao tác dễ thực hiện, dễ nâng cấp quy mô. Dung môi điều chế được lựa chọn là EtOH có giá thành rẻ, dễ thu hồi giúp tiết kiệm dung môi và ít gây độc hại. So với phương pháp sắc thuốc truyền thống, ngâm ở nhiệt độ phòng thí nghiệm không gây phân hủy hoạt chất bị phân hủy với ở nhiệt độ cao; dung môi EtOH chiết được nhiều hoạt chất ít phân cực và ít hòa tan tạp chất (tinh bột, protein, …) hơn dung môi nước. Theo quy định về tiêu chuẩn cao lỏng trong DĐVN V [6], cao lỏng điều chế được đạt các chỉ tiêu về cảm quan màu sắc, thể chất, mùi vị.
- Về định tính bằng sắc ký lớp mỏng, hệ dung môi toluen: ethanol: acid acetic băng (8: 2: 0,5) đã tách được physcion, emodin và một số hoạt chất khác rõ nét hơn so với hệ dung môi pha động trong DĐVN V [6]. So với Dược điển Mỹ [29], chúng tôi đã sử dụng EtOAc là dung môi chuẩn bị mẫu chấm SKLM. Kết quả sắc ký đồ cho thấy EtOAc hòa tan nhiều hoạt chất trong các mẫu dược liệu và cao lỏng tốt hơn MeOH. Từ đó, chúng tôi đã lựa chọn sử dụng dung môi EtOAc cho bước chuẩn bị mẫu thử của phép phân tích định lượng THSG trong hà thủ ô đỏ chế và hai mẫu cao lỏng. So sánh sắc ký đồ của dược liệu sống và dược liệu chế, chúng tôi nhận thấy rằng các vết trong sắc ký đồ của hà thủ ô đỏ chế tách rõ nét hơn so với hà thủ ô đỏ chưa chế biến. Qua đây, có thể thấy rằng, chế biến hà thủ ô đỏ làm giảm tạp chất có trong dược liệu mà vẫn giữ được những hoạt chất có trong đó.
- Về kết quả định lượng THSG trong mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ chế, cao cồn 50% và cao nước, mẫu hà thủ ô đỏ chế khảo sát đạt quy định về hàm lượng THSG trong Dược điển Trung Quốc [15] (hàm lượng THSG trên 0,7%). Mặt khác, hàm lượng THSG trong mẫu cao lỏng chiết bằng cồn 50% cao hơn hàm lượng THSG trong mẫu dược liệu. Điều này cho thấy, tỉ lệ dung môi: dược liệu, thời gian chiết, và số lần chiết ảnh hưởng tới nồng độ hoạt chất chiết được từ hà thủ ô đỏ chế. Hàm lượng THSG trong mẫu cao chiết cồn 50% cao hơn hàm lượng THSG trong
34
mẫu cao nước chứng tỏ THSG đã bị phân hủy trong quá trình chiết nước ở nhiệt độ cao.
35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT