Cảm biến trở kháng có hai loại phổ biến đó là cảm biến trở kháng faradaic và non-faradaic dựa trên bản chất dung dịch đầu dò sử dụng tương ứng có redox hoặc không có redox [6]. Trở kháng non-faradaic là một dạng DC của trở kháng mà các tính chất điện được sinh ra bởi tụ điện lớp kép; trong khi đó, trở kháng faradaic được tạo ra khi phản ứng oxi hóa khử điện hóa xảy ra [78]. Phản ứng này sẽ sinh ra các electrons và các electrons được truyền đến bề mặt điện cực
[11, 62, 63].
Hình 1. 13. Cơ chế truyền điện tích của cảm biến trở kháng điện hóa dựa trên công nghệ MIP.
Trên hình 1.13 trình bày cơ chế truyền điện tích của cảm biến trở kháng phức dựa trên công nghệ MIP. Nguyên lý hoạt động cơ bản của cảm biến dựa trên sự thay đổi tính chất điện trên bề mặt điện cực. Do đó, bất kì sự thay đổi nào của phổ tổng trở đều liên quan đến sự thay đổi của các giá trị bề mặt. Khi trên bề
NGỤY PHAN TÍN 48
mặt điện cực được biến tính bởi bất kỳ một loại vật liệu hoặc xảy ra quá trình đặc biệt, do tính chất điện đặc trưng của mỗi loại vật liệu và phản ứng sẽ ảnh hưởng đến độ dẫn điện của cả hệ điện hóa. Sự thay đổi này có thể đánh giá được thông qua phương pháp EIS. Dựa trên việc quan sát sự thay đổi của phổ tổng trở trên mặt phẳng Nyquist, gồm hai thành phần: phần bán cung tròn (ở vùng tần số cao liên quan đến quá trình truyền điện tích) và phần tuyến tính (ở vùng tần số thấp liên quan đến hiện tượng khuếch tán trong quá trình điện hóa). Chúng ta cũng có thể đánh giá được một cách sơ bộ tính chất bề mặt điện cực sau các bước biến tính. Giá trị của các thành phần trong phổ trở kháng có thể được xác định bằng cách fit theo mô hình mạch tương đương Randles. Từ các đánh giá thu được, chúng ta có thể đưa ra các phương án để kiểm soát và hoàn thiện các bước khác nhau trong quá trình chế tạo cảm biến. Thêm nữa, EIS cũng là công cụ phân tích hiệu quả để xác định sự thay đổi độ dẫn điện và tính chất điện môi của điện cực tương ứng sự với sự tăng lên của nồng độ chất cần phân tích. Hiện nay cảm biến trở kháng faradaic thường sử dụng trong cảm biến hệ ba điện cực, bao gồm: điện cực làm việc (WE), điện cực đối (CE) và điện cực so sánh Ag/AgCl (RE). Hệ ba điện cực trong dung dịch đầu dò faradaic có thể phân tích thành mô hình tương đương Randles bao gồm trở kháng dung dịch, điện dung lớp kép và tổng trở của quá trình Faraday. Tổng trở Faraday có thể chia thành hai cách tương đương: một điện trở RS mắc nối tiếp với giả điện dung CS hoặc điện trở chuyển điện tích RCT và tổng trở khuếch tán ZW. Dựa vào mô hình tương đương, tổng trở thu được cho phép phân tích đóng góp của các quá trình điện hóa như khuếch tán, điện tích lớp kép, phản ứng hóa học… vào quá trình điện cực. Trong đó, giá trị RCT mô tả tính dẫn điện gây ra bởi độ dẫn khối của hệ điện cực hoặc quá trình truyền điện tích do phản ứng điện cực gây ra; Cdl mô tả vùng phân cực tích điện không gian cũng như sự biến tính trên bề mặt điện cực do các quá trình hấp phụ hoặc phủ một lớp màng điện môi gây ra; ZW phản ánh ảnh hưởng của quá trình vận chuyển khối của các phân tử tích điện lên tổng trở hệ điện hoá [24]. Khi thực hiện các biến tính trên bề mặt điện cực, tín hiệu phổ tổng
NGỤY PHAN TÍN 49
trở sẽ thay đổi do có sự thay đổi về hình thái học và các tính chất điện của điện cực dẫn đến các giá trị Cdl và RCT thay đổi khá lớn, trong đó rõ rệt nhất là sự thay đổi của điện trở RCT. Nồng độ các chất cần phân tích sẽ được xác định dựa trên sự thay đổi của delta RCT.
NGỤY PHAN TÍN 50
Chương 2-THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1. Hoá chất
Tên Kí hiệu % Purity Xuất sứ
4-Aminothiolphenol p-ATP 98% Sigma Aldrich, Đức
Alanine 98% Sigma Aldrich, Đức
Axit Clohydric 37% HCl Merck, Đức
Axit Sulfuric 98% H2SO4 Merck, Đức
Axit Tetrachloroauric HAuCl4 98% Sigma Aldrich, Đức
Cysteamine 98% Sigma Aldrich, Đức
Ethanol ≥ 99.9% Merck, Đức
Lysine 98% Sigma Aldrich, Đức
Muối di-Sodium hydrogen
phosphate Na2HPO4 ≥ 99.5% Merck, Đức
Muối Potassium chloride KCl ≥ 99.5% Merck, Đức
Muối Potassium
dihydrophosphate KH2PO4 ≥ 99.5% Merck, Đức
Muối Potassium
ferricyanide K3[Fe(CN)6] ≥ 99.5% Merck, Đức
Muối Potassium
ferrocyanide K4[Fe(CN)6] ≥ 99.5% Merck, Đức
Muối Sodium chloride NaCl ≥ 99.5% Merck, Đức
Sarcosine 98% Sigma Aldrich, Đức
Trong nghiên cứu này, các hóa chất sử dụng được mua từ các hãng hóa chất uy tín với độ tinh khiết cao (trên 98%), đạt đến mức độ dùng phân tích mà không cần phải tinh chế thêm. Hóa chất được pha trong nước deion có điện trở suất từ 18 Mcm trở lên.
Dung dịch đệm phosphate-buffered saline (PBS) được pha từ các muối natri phosphate và natri clorua trong nước deion sao cho nồng độ đạt 100 mM. Dung
NGỤY PHAN TÍN 51
dịch PBS 100 mM sau khi pha được chuẩn độ pH dựa trên máy Hanna HI 8314 membrane pH-meter 0,00-14,00.
Dung dịch ferro ferrit được sử dụng làm dung dịch đầu dò để khảo sát hoạt động cảm biến. Các muối K4Fe(CN)6 và K3Fe(CN)6 được pha trong dung môi KCl 0.1 M /PBS 0.05 M sao cho đạt nồng độ 5 mM.
2.1.2. Thiết bị phân tích điện hóa
Tất các thí nghiệm điện hóa được thực hiện bằng thiết bị phân tích điện hóa của hãng Vertex Ivium (Ivium Technologies BV, Hà Lan) tại nhiệt độ phòng. Thiết bị này được kết nối với máy tính cá nhân và các chế độ đo được điều khiển bằng phần mềm Ivium software đi kèm của hãng. Thông qua phần mềm chúng ta có thể cài đặt và thiết lập các chế độ điện hóa phù hợp với các yêu cầu của quá trình chế tạo cảm biến điện hóa. Các tín hiệu phản hồi dựa trên điện thế và dòng của các quá trình điện hóa có thể quan sát trực tiếp ngay trên màn hình theo dõi giúp cho chúng ta có thể kiểm soát và hoàn thiện các quá trình điện hóa một cách thuận lợi. Đồng thời, kết quả đo cuối cũng sẽ được hiển thị trên màn hình và có thể sao lưu thành các định dạng thuận lợi cho việc xử lý số liệu sau này.Trên hình 2.1 biểu diễn giao diện hiển thị của phần mềm điều khiển thiết bị phân tích điện hóa Vertex Ivium.
NGỤY PHAN TÍN 52
Thiết bị Ivium Vertex có sáu chế độ hoạt động: (1) LinearSweep; (2) CyclicVoltammetry; (3) Transients; (4) Electroanalysis; (5) Impedance; (6) Corrosion. Trong nghiên cứu này, chế độ CyclicVoltammetry được sử dụng để thực hiện các thí nghiệm điện hóa tạo màng MIP/NIP, tổng hợp và phân tán hạt nano Au (AuNPs), làm sạch đế... Chế độ Impedance được sử dụng thực hiện các phép đo trở kháng phức của quá trình chế tạo cũng như hoạt động của cảm biến. Phép đo phổ trở kháng phức này được thực hiện trong dung dịch ferro/ferrit, dải tần số từ 100 kHz đến 50 mHz với dòng xoay chiều có giá trị biên độ điện áp 10 mV.
2.1.3. Điện cực in các bon (SPCE) và in vàng (SPAuE)
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hai loại điện cực chế tạo theo công nghệ in lưới màng dày (thick film screen printing technology) của hãng BioDevice Technology, Nhật Bản. Cấu trúc của hai loại điện cực này gồm 3 điện cực được tích hợp trên đế nhựa: điện cực làm việc (các bon/vàng), điện cực đối (các bon), điện cực so sánh (Ag/AgCl). Diện tích bề mặt của điện cực làm việc là 2.64 mm2 (đối với SPCE) và 3.62 mm2 (đối với SPAuE).
2.1.4. Các thiết bị phụ trợ
Ngoài thiết bị phân tích điện hóa Ivium Vertex, một số máy móc thiết bị khác được sử dụng trong nghiên cứu này để phục vụ cho các thí nghiệm trong suốt quá trình nghiên cứu và chế tạo cảm biến.
• Máy quay ly tâm Prism • Máy rung siêu âm Sono Swiss • Máy vertex VELP Scientifica • Máy đo pH Hanna HI 8314
NGỤY PHAN TÍN 53
2.2. Quy trình công nghệ chế tạo cảm biến sarcosine - MIP
2.2.1. Chuẩn bị điện cực in carbon biến tính hạt vàng (AuNPs-modifed SPCE) SPCE)
Hình 2. 2. Đặc trưng dòng-thế khi hệ điện cực được quét CV 20 vòng trong dung dịch PBS 100 mM chứa 1 mM HAuCl4 với tốc độ quét 50 mV trong dải điện áp từ -0.6 V đến 0.5 V so với điện cực Ag/AgCl.
Trước tiên, chúng tôi sử dụng phương pháp điện hóa quét thế vòng (cyclic voltamtry) để tổng hợp và phân tán một lớp mỏng hạt vàng có kích thước nano lên trên bề mặt điện cực làm việc của SPCE. Phương pháp này cho phép tạo được hạt vàng có kích thước khá nhỏ và phân tán đồng đều trên bề mặt điện cực
[42]. Dung dịch HAuCl4 nguyên gốc ban đầu sẽ được pha vào trong dung dịch đệm PBS 100 mM và pha loãng đến nồng độ 1 mM mong muốn. Sau đó, 35 µL dung dịch HAuCl4 1 mM được nhỏ lên trên bề mặt SPCE sao cho bao phủ cả 3 điện cực (bao gồm cả Ag/AgCl, điện cực đối và điện cực làm việc). Để phủ hạt vàng với kích thước và mật độ thích hợp lên điện cực, phần mềm được thiết lập ở chế độ quét thế vòng trong dải điện áp từ -600 mV đến +500 mV so với điện cực Ag/AgCl, tốc độ quét 50 mV/s với các số vòng quét khác nhau, 10, 15 và 20 vòng. Điện cực sau đó được rửa vài lần bằng ethanol và nước cất hai lần, sau đó sấy khô nhẹ bằng dòng khí N2. Để làm sạch bề mặt điện cực chúng tôi tiến
NGỤY PHAN TÍN 54
hành quét điện cực trong dung dịch H2SO4 1 M với tốc độ quét 50 mV/s trong dải điện áp từ -200 đến +1400 mV so với điện cực Ag/AgCl cho đến khi thu được đáp ứng điện hóa ổn định (thông thường quét 5 vòng). Tiếp theo, điện cực được rửa vài lần bằng ethanol và nước cất hai lần, sấy khô nhẹ bằng dòng khí N2. Điện cực carbon biến tính hạt vàng (AuNPs-modified SPCE) đã sẵn sàng để sử dụng cho quá trình tổng hợp màng MIP (NIP) tiếp sau đó.
Hình 2.2 biểu diễn đặc trưng dòng thế khi biến tính điện cực in các bon bằng lớp hạt Au mỏng phân tán đều trên bề mặt bằng phương pháp quét thế vòng. Kết quả cho thấy trên đặc trưng dòng thế tồn tại đỉnh khử Au(III) sang Au (0) tại điện áp -0.4 V vs. Ag/AgCl.
Đối với điện cực in carbon, việc biến tính bề mặt điện cực bằng cách phủ hạt Au sẽ giúp cho các monomer p-ATP có thể đính chắc lên mặt đế, làm nền móng cho việc tạo polymer sau này. Mật độ và kích thước của hạt vàng sẽ ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng màng polymer. Hai yếu tố này có thể kiểm soát được bằng cách thay đổi nồng độ dung dịch HAuCl4, dung dịch đệm, dải điện áp sử dụng hoặc số vòng quét [42].
2.2.2. Quy trình công nghệ chế tạo sarcosine-MIP/SPAuE và sarcosine- MIP/AuNPs/SPCE
Hình 2. 3. Sơ đồ quy trình chế tạo cảm biến điện hóa phổ tổng trở phát hiện sarcosine sử dụng điện cực SPCE.
NGỤY PHAN TÍN 55
Trên hình 2.3 trình bày sơ đồ quy trình công nghệ chế tạo màng MIP trên đế SPAuE và AuNPs-modified SPCE. Quy trình gồm có 4 bước chính:
Bước 1: Tạo lớp màng SAM trên đế SPAuE và AuNPs-modified SPCE
Đầu tiên, p-ATP được hòa tan trong dung môi ethanol để đạt được nồng độ 25 mM. Ngâm đế SPAuE và AuNPs-modified SPCE trong dung dịch này, để qua đêm trong buồng tối ở nhiệt độ phòng (khoảng 15 tiếng). Một lớp đơn phân tử
p-ATP sẽ được hình thành do sự tự lắp ráp của các phân tử p-ATP lên trên bề mặt của Au thông qua liên kết thiol Au-S giữa hạt vàng và nguyên tử lưu huỳnh của nhóm –SH (thiol) trong phân tử p-ATP. Như vậy trên bề mặt điện cực lúc này sẽ có một lớp màng SAM có nhóm –NH2 hướng ra ngoài. Các nhóm –NH2
đóng vai trò là đích oxy hóa để tạo mạch chính cũng như là liên kết chéo trong quá trính polymer hóa. Màng SAM hình thành từ các phân tử p-ATP có độ ổn định và tính dẫn điện tốt hơn so với các đồng phân khác của aniline như o-ATP và m-ATP, làm tăng hiệu suất hình thành màng PATP trên bề mặt điện cực[19]
Bước 2: Gắn các phân tử Sarcosine
Trong bước này sarcosine được gắn trên bề mặt điện cực làm việc do lực hút tĩnh điện (giữa đế Au và phân tử sarcosine phân cực). Đầu tiên, 5 mM sarcosine được phân cực trong môi trường axit nhẹ HCl nồng độ 5 mM. Lấy 35 µL dung dịch này nhỏ lên bao trùm cả 3 điện cực trên đế và tiến hành áp thế -600 mV vs. Ag/AgCl trong 600 s. Trong thời gian này các nguyên tử Nitơ trong nhóm –NH bị proton hóa thành nhóm –NH2+. Dưới điện thế không đổi, các phân tử sarcosine có nhóm chức –NH2+ được kéo lại gần bề mặt điện cực biến tính p- ATP bằng lực hút tĩnh điện.
Bước 3: Tạo màng polymer in phân tử (MIP)
Dung dịch tạo màng polymer được pha trong dung dịch đệm 100 mM KCl/ 50 mM PBS chứa 12 mM p-ATP, 3 mM sarcosine. 35 L dung dịch này được nhỏ lên bao trùm cả 3 điện cực của đế. Tiến hành quét thế vòng trong dải điện áp từ -200 mV to +600 mV vs. Ag/AgCl với tốc độ quét là 50 mV/s với số vòng quét khác nhau. Tùy theo số vòng quét mà bề dày của màng MIP thay đổi. Dưới điều
NGỤY PHAN TÍN 56
kiện thí nghiệm, quét thế vòng khoảng 15 CVs màng film với độ dày thích hợp sẽ được hình thành trên đế carbon biến tính hạt vàng và điện cực vàng. Màng polymer được hình thành thông qua liên kết polymer liên hợp của cặp electron của nguyên tử nitơ của phân tử p-ATP, tạo thành chuỗi PATP có cấu trúc xen kẽ giữa vòng phenyl và nhóm chức chứa gốc nito. Trong môi trường có độ pH là 6.86, các nguyên tử N sẽ bị proton hóa ở một mức độ nhất định tạo ra các hạt mang điện hình thành trong ma trận polymer giúp cho màng MIP có tính dẫn điện. Trong quá trình trùng hợp các phân tử sarcosine sẽ liên kết với các phân tử p-ATP trong chuỗi polymer thông qua liên kết hidro giữa nguyên tử O/N với nguyên tử H (giữa nguyên tử O của sarcosine với H của nhóm NH của p-ATP, giữa nguyên tử H của nhóm OH với nguyên tử N của p-ATP, giữa H và N của sarcosine hoặc p-ATP). Tỉ lệ giữa sarcosine và p-ATP sẽ ảnh hưởng lớn tới số liên kết được tạo thành giữa sarcosine và màng, đồng thời cũng ảnh hưởng đến số lượng khuôn in hiệu dụng trên bề mặt màng và độ ổn định của màng. Tỉ lệ nồng độ giữa monomer và mẫu thường được chọn trong khoảng 3:1 đến 6:1 để màng được tổng hợp tốt nhất [58, 80, 84]. Trong nghiên cứu này, tỉ lệ giữa monomer
p-ATP và mẫu sarcosine được lựa chọn là 4:1 dựa trên đặc điểm kích thước và cấu tạo của phân tử sarcosine, là một chất có kích thước khá nhỏ và có nhóm chức ở hai đầu mạch. Màng MIP sau khi được tạo thành sẽ được áp thế tĩnh (+600 mV vs Ag/AgCl) trong dung dịch HCl và rửa sạch bằng ethanol và nước cất hai lần để loại bỏ sarcosine tạo ra các khuôn in có các vị trí liên kết. Các khuôn in này chọn lọc các phân tử cần phát hiện bằng kích thước, hình dạng và các vị trí liên kết.
Bước 4: Loại bỏ các phân tử sarcosine ra khỏi màng MIP
Để loại bỏ các phân tử sarcosine ra khỏi màng MIP, điện cực sau khi đã biến tính màng MIP được tiến hành áp thế tĩnh 600 mV vs Ag/AgCl với thời gian 600s trong môi trường HCl 1 M. Trong bước này, điện áp một chiều sẽ phá vỡ liên kết hydro giữa phân tử sarcosine được proton hóa với màng polymer và loại bỏ chúng ra khỏi ma trận polymer. Do đó các khuôn in bù với các phân tử
NGỤY PHAN TÍN 57
sarcosine về hình dạng, kích thước và các liên kết đặc hiệu sẽ được hình thành. Sau đó, điện cực được rửa lại bằng ethanol và nước cất hai lần thật cẩn thận rồi