Theo Xvenson, bức xạ ion hóa có thể gây nên sự phân đoạn của nhiễm sắc thể. Có hai kiểu phân đoạn nhiễm sắc thể là:
- Loại đứt thật: đứt rời thành từng khúc.
- Loại tiềm tàng: chƣa đứt rời mà ở trạng thái tiềm tàng, có thể chuyển sang đột biến sau một thời gian nhất định hoặc phục hồi lại trạng thái ban đầu. Crogodin và Lutxomic cho rằng, phóng xạ ion hóa có thể hủy hoại nhiễm sắc thể một cách trực tiếp và kéo dài. Nếu có các điều kiện tƣơng ứng và đủ về thời gian thì sự hủy hoại tiềm tàng có thể trở thành hiện thực, đột biến bắt đầu trong cấu trúc nhiễm sắc thể.
Nói chung, khi xử lý các tác nhân phóng xạ ion hóa ở liều lƣợng trung bình cho đến liều lƣợng không qua ngƣỡng chịu đựng của tế bào thì ở kỳ sau của nguyên phân thấy xuất hiện cầu, đoạn, vòng khuyên... hiện tƣợng chuyển đoạn lớn và nhỏ hoặc đảo đoạn thƣờng đƣợc phát hiện trong giảm phân, đó là sai hình nhiễm sắc thể. Mức độ sai hình nhiễm sắc thể thể hiện bằng các kiểu cấu trúc lại nhiễm sắc thể tăng dần theo liều chiếu xạ.
1.3.4.2 Tác động của tia gamma (Co60) lên quá trình phân chia tế bào
Trong quá trình nguyên phân, tia gamma có thể gây ra hiệu quả sau:
- Làm kìm hãm hay tạm dừng quá trình nguyên phân bằng cách kéo dài một pha nào đó trong chu kỳ tế bào.
- Làm dừng hoàn toàn quá tình nguyên phân nhƣng không gây chết tế bào mà làm mất khả năng phân chia tế bào.
- Làm tăng độ nhớt và kết dính nhiễm sắc thể dẫn đến sự chết tế bào
- Đôi khi chiếu xạ liều thấp lại kích thích sự phân chia tế bào. Khi xử lý phóng xạ có thể tiến hành theo các phƣơng pháp sau:
- Ngâm hạt trong dung dịch đồng vị phóng xạ.
- Trồng cây trên đất có chất đồng vị phóng xạ.
- Đƣa chất đồng vị phóng xạ vào cây.
- Phóng xạ thực vật trong quá trình sinh trƣởng và phát triển
1.3.5 Những điểm cần lƣu ý khi thực hiện chiếu xạ đột biến bằng tia gamma
Đặt vật liệu vuông góc với nguồn bức xạ trong suốt thời gian chiếu xạ Duy trì ẩm độ của mẫu chiếu xạ thích hợp từ 12 – 20% (Tano và ctv., 2004) Theo Nguyễn Văn Hiển (2000) có quan niệm cho rằng để thu đƣợc nhiều đột biến, nên dùng liều lƣợng chiếu xạ cao. Vì liều lƣợng cao để cho sự sống sót 10% thì việc thu thập các đột biến sẽ càng có hiệu quả. Tuy nhiên nhiều công trình thử nghiệm không tán thành quan điểm này. Do vậy ngày nay ngƣời ta thƣờng chiếu xạ ở liều lƣợng thấp hoặc trung bình.
1.4MỘT SỐ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TIA GAMMA TRONG CHỌN
TẠO GIỐNG
Bên cạnh những thành tựu trong chọn tạo giống bằng các phƣơng pháp truyền thống, trong các năm gần đây ngày càng có nhiều thành tựu trong lĩnh vực chọn tạo giống bằng phƣơng pháp chọn giống bằng phƣơng pháp đột biến, làm nguyên liệu cho chọn tạo truyền thống.
Trƣơng Thị Bích Phƣợng và ctv. (2003) đã xử lý chiếu xạ ở hai liều lƣợng 12 và 20 krad trên mô sẹo cây lúa Oryza sativa L., sau đó lần lƣợt chuyển qua môi trƣờng nuôi cấy mannitol 3%/4 tuần, 6%/4 tuần, 9%/4 tuần, và 12%/4 tuần. Các khối mô sẹo còn sống ở liều lƣợng 12% mannitol sẽ đƣợc chuyển sang môi trƣờng 15% mannitol trong 3 tháng. Sau 3 tháng nuôi cấy trong môi trƣờng mannitol 15%, tỷ lệ sống sót của liều lƣợng chiếu xạ 15 krad là 82,83%, của liều lƣợng chiếu xạ 20 krad là 75,53%.
Lê Duy Thành và ctv. (2003) đã xử lý chiếu xạ tia Gamma trên mô sẹo các giống lúa Tám Xoan, Tám Ấp Bẹ, Dự Thơm, Tẻ Dị Hƣơng với các liều lƣợng 3, 5, 7, 9, 11, 13 krad. Sau đó chuyển sang môi trƣờng tái sinh cây MS + 3% saccharose + 0,8% agarose + 0,2 ml/l NAA + 2 ml/l BA, và môi trƣờng hoàn chỉnh sau 4 tuần MS + 3% saccharose + 0,8% agarose + 0,2 ml/l NAA. Kết quả cho thấy liều lƣợng chiếu xạ càng cao thì tỷ lệ sống sót của các mô sẹo càng giảm, sự mẫm cảm của mô sẹo phụ thuộc vào nguồn gốc các giống lúa. Cùng liều lƣợng chiếu xạ tỷ lệ mô sẹo của các giống Tẻ Si Hƣơng và Tám Ấp Bẹ cao hơn các giống Dự Hƣơng và Tám Xoan. Ở liều lƣợng 13 krad tỷ lệ sống sót của mô sẹo giống Dự Hƣơng chỉ còn 2,4% trong khi các giống khác là hơn 20%. Sau khi chuyển sang thuần dƣỡng, tỷ lệ chiếu xạ càng cao thì tỷ lệ sống sót càng giảm, ở liều lƣợng chiếu xạ 3 krad tái sinh đƣợc 637 cây và ở liều lƣợng 13 krad chỉ tái sinh đƣợc 2 cây. Đa số các cây ở liều lƣợng 11 và 13 krad đều bị bạch tạng và biến dạng.
khô), nhằm xác định liều lƣợng ở thế hệ M1 có từ 30-40% cây sống và ra hoa kết trái. Kết quả thu đƣợc liều lƣợng chuẩn có khả năng gây đột biến ở giống MTD7 ở trạng thái ngâm ủ là 35,5 – 63,4 Gy, hạt không ngâm ủ là 6,53 – 115,4 Gy, hạt khô là 372,4 – 1,012 Gy; trên giống L14 ở trạng thái ngâm ủ là 40,9 – 75,6 Gy, hạt không ngâm ủ là 48,4 – 91,2 Gy và hạt khô là 174,3 – 425,6 Gy; chiếu xạ tia gamma có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và năng suất của các giống đậu nành MTD7 và L14, tỷ lệ nảy mầm và sống cao, chiều cao cây và số cành, tỷ lệ cho trái và năng suất giảm khi liều lƣợng xử lý càng cao.
Một số nghiên cứu ứng dụng tia gamma trong chọn tạo giống cây mè
Sarwar và ctv. (2010) đã tiến hành chiếu xạ ba kiểu gen mè: TS3, Sanghar-1 và GP3804 với tia gamma từ 100Gy-800Gy và đƣợc trồng nhƣ thế hệ M1 trong năm 2003. Đột biến mong muốn đƣợc lựa chọn từ sự phân biệt (M2) trong năm 2004 và khẳng định ở năm 2005 trong thế hệ M3. Dòng giống lựa chọn đúng đƣợc tiếp tục nghiên cứu về biểu hiện di truyền khác nhau của chúng với những đặc điểm hình thái học/nông học và kinh tế. Dựa trên những thông tin di truyền, sáu giống (NS11- 2, NS11P2, NS100P2, NS103 -1, NS240P1 và NS260) sở hữu năng suất hạt giống cao hơn, kháng bệnh và các thuộc tính mong muốn khác đã đƣợc lựa chọn. Chúng đƣợc đánh giá ba năm liên tiếp 2006-2008, trong các thử nghiệm năng suất tại Viện hạt nhân Nông nghiệp và Sinh học, Faisalabad, Pakistan. Kết quả phân tích kết hợp phƣơng sai cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa giữa các kiểu gen , môi trƣờng và sự tƣơng tác của chúng (kiểu gen x môi trƣờng). Nó chỉ ra sự khác biệt kiểu gen trong các môi trƣờng khác nhau trong ba năm liên tiếp. Tổng thể chỉ ra rằng hạt giống dòng đột biến NS100P2, NS11-2 và NS103-1 sản xuất hạt giống năng suất cao hơn (năm 1871, 1547 và 1439 kg/ha) so với dòng đột biến khác. NS100P2 có hệ số hồi quy lớn hơn sự thống nhất, do đó thích hợp cho môi trƣờng thuận lợi. Tƣơng tự nhƣ vậy NS11 -2 cũng có hồi quy hệ số lớn hơn sự thống nhất và độ lệch chuẩn gần bằng không. Dòng đột biến NS103 -1 chứng minh là ổn định hơn bởi vì nó đƣợc sản xuất cao hơn có nghĩa là sản lƣợng hạt giống cùng với hệ số hồi quy gần với sự thống nhất và độ lệch để hồi quy là gần bằng không. Dòng đột biến NS 260 có khả năng chống chịu đƣợc mƣa lớn và gió bão. Tất cả các dòng đột biến đƣợc nghiên cứu cũng cho thấy nhiều chỉ số thu hoạch và sức đề kháng với bệnh tật hơn so với TS3.
Anbarasan và ctv. (2013) đã phân tích tác động của tia gamma trên sự nảy mầm và phát triển cây mè (sesamun indicum L.). Những hạt giống của kiểu gen mè TMV3 đƣợc tiếp xúc với liều lƣợng khác nhau của các tia gamma nhƣ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 và 100 KR. Sự ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma đƣợc quan sát thấy trên sự nảy mầm và tăng trƣởng qua các thông số nhƣ tỷ lệ nảy mầm (%), chiều cao cây con, chiều dài gốc, số lƣợng chi nhánh của rễ và sức sống cây con (chỉ số Vigour). Khi tăng liều lƣợng bức xạ thì sự nảy mầm và kích thƣớc giống giảm 50%. Quan sát thấy ở chiếu xạ tia gamma 50 KR trên cây giống đã đƣợc coi là giá trị LD50 (liều tối ƣu) đối với các tia gamma trên mè.
Tổ chức Lƣơng thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO) tổ chức một số vấn chuyên gia về giống mè từ năm 1981 đến năm 1987, tất cả đều khuyến khích việc sử dụng các đột biến cảm ứng cho việc tăng cƣờng đa dạng di truyền.
Maneekao và ctv. (1998) đã nghiên cứu về cải thiện mè nhằm giảm tổn thất hạt giống bằng đột biến đƣợc tiến hành tại Trung tâm nghiên cứu cây trồng Ubonratchathani (UBFCRC ). Thí nghiệm đƣợc thực hiện để cải thiện trái nang của mè cho đặc điểm không mở bằng cách sử dụng tia gamma. Thực hiện nghiên cứu tác động trên mè khi áp dụng chiếu xạ với liều khác nhau 200-750 Gy. Kết quả thí nghiệm cho thấy tất cả các dòng mè có liều lƣợng LD50 khi chiếu xạ với tia gamma giữa 300-750 Gy. Thí nghiệm thứ hai đã đƣợc thực hiện để điều tra tác động của chiếu xạ lên sự mở của các loại trái nang của mè. Ba giống địa phƣơng: Red Pitsanulok, Burirum đen và Granuan trắng đƣợc chiếu xạ tia gamma với 500Gy.
Trong mùa khô 1997-1998 , 24 cây của thế hệ M7 (dòng hạt giống màu đen - đỏ) và 8 cây của thế hệ M5 (dòng hạt giống trắng) đã đƣợc lựa chọn để đánh giá năng suất với ba giống địa phƣơng. Kết quả cho thấy tỷ lệ kháng mở trái của các giống: PMUB 1, PMUB 19 có tỷ lệ kháng mở là 537 và GMUB 7 có tỷ lệ kháng mở là 637 năm 1997-98 và có tỷ lệ kháng mở 772 vào năm 1997. Các giống trên đều cho 27 % sản lƣợng hạt giống cao hơn ban đầu. Bên cạnh đó, Anyanga (1995) Hạt giống của năm giống mè: T- 85, Serra, EM- 14, Anyana và S đã đƣợc chiếu xạ tia gamma với liều lƣợng 0, 200, 300, 400, 600 và 800 Gy. Hạt bức xạ đã đƣợc trồng để sản xuất các cây M1. Hồ sơ lƣu đƣợc về tỷ lệ nảy mầm sau bốn ngày và ba tuần, sức sống sau ba tuần nảy mầm. Nhiều suy giảm trong tăng trƣởng đƣợc ghi nhận từ các liều 600 và 800 Gy. Năm trái/cây từ mỗi giống mỗi liều đã đƣợc thu hoạch để phát triển dòng M2. 276 cây duy nhất lựa chọn trong số 2.636 cây từ tất cả các giống. Trong số 276 cây đƣợc lựa chọn và trồng , 30 dòng con cháu của các cây lựa chọn để đƣợc kiểm tra trong một thử nghiệm năng suất sơ bộ. Từ năm giống về 7.000 hạt mỗi giống mỗi liều đã một lần nữa đƣợc chiếu xạ với 300, 400, 500, và 600 tia gamma Gy.
Ayiecho và ctv. (1997), trong nỗ lực để cải thiện năng suất của các giống mè ở Kenya, những hạt giống của ba giống: SPS SIK6, SIK 096 và SPS SIK 50/1 đã đƣợc chiếu xạ tia gamma liều lƣợng 300Gy, 400Gy và 600Gy. Thế hệ thí nghiệm 1: M1, M2, M3 và M4 và thế hệ M1 của thí nghiệm 2 đã đƣợc trồng tại trƣờng Đại học Nairobi, Kibwezi 1994-1996. M6 và M7 của thế hệ thí nghiệm 1 và M2 của thí nghiệm 2 đã đƣợc trồng tại Siaya Farmer's Training Centre vào năm 1997. Những ảnh hƣởng của bức xạ trong thế hệ M1 là giảm và chận sự nảy mầm cây con, giảm chiều cao cây, các cây bị biến dạng , chậm ra hoa và năng suất rất thấp. Có sự thay đổi ở M2, hầu hết đặc điểm đánh giá tăng. Các cây trong M2 và các thế hệ tiếp theo đƣợc lựa chọn qua đặc điển hình thái để tăng số lƣợng trái. Kết quả của lựa chọn là tổng cộng 88 dòng từ thế hệ M4 đƣợc sử dụng để lấy thế hệ M5, lựa chọn thêm trong thế hệ M6 35 dòng đƣợc giữ lại để thử nghiệm năng suất sơ bộ trong thế hệ M7.
CHƢƠNG 2
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1.THỜI GIAN THỰC HIỆN
Thí nghiệm đƣợc tiến hành từ tháng 5/2012 đến tháng 12/2013.
2.2.ĐỊA ĐIỂM
Thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng nuôi cấy mô Bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Nông nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại Học Cần Thơ.
2.3.PHƢƠNG TIỆN
2.3.1. Vật liệu và trang thiết bị
Vật liệu: Hạt của hai giống mè trắng (Cần Thơ và An Giang) và mè đen
(Cần Thơ và An Giang) đƣợc xử lý tia phóng xạ Gamma dùng làm vật liệu cho thí nghiệm.
Hạt giống mè đƣợc xử lý tia gamma Co60
tại Viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt. Các liều nghiên cứu: 0 Gy, 25 Gy, 30 Gy, 35 Gy, 50 Gy.
Trang thiết bị: Sử dụng trang thiết bị của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô
nhƣ: keo thủy tinh, dụng cụ pha môi trƣờng (ca nhựa, ống đong, pipet,…), nồi hấp thanh trùng, tủ sấy, tủ cấy, máy đo pH,…
2.3.2. Điều kiện thí nghiệm
Phòng nuôi cấy mô đƣợc trang bị máy điều hòa nhiệt độ, đèn neon. Nhiệt độ phòng đƣợc duy trì là 26 20C
Cƣờng độ chiếu sáng 1500 lux. Thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày.
Hóa chất:
Khoáng đa lƣợng (NH4NO3, KNO3, KH2PO4, MgSO4. 7H2O, CaCl2. 2H2O).
Khoáng vi lƣợng (MnSO4. H2O, ZnSO4. 4H2O, H3BO3, KI, Na2MoO4. 2H2O CuSO4.5 H2O, CoCl2. 6 H2O, Na2EDTA, FeSO4. 7H2O, Fe-EDTA).
Chất điều hòa sinh trƣởng: Benzyl adenin (BA), Indole-3-Butyric Acid (IBA).
Vitamin (thiamin, pyridoxin, nicotinic).
Hóa chất khử trùng: Chlorin 10%, HgCl2 0,1% cồn 700, NaOH 1N, HCl 1N.
Thành phần khác:
Đƣờng sucrose. Agar.
Nƣớc dừa.
Than
Các máy móc dụng cụ: cân điện tử, tủ lạnh, máy đo pH, nồi hấp khử trùng,
tủ cấy vô trùng, ống đong, keo thuỷ tinh, kẹp giấy, dao cắt mẫu, giấy,…
2.4. PHƢƠNG PHÁP
2.4.1. Khử trùng và tạo mẫu cấy
Hạt mè đƣợc rửa sạch bằng xà phòng, lắc đều trong 10 phút, sau đó đƣợc rửa sạch trên vòi nƣớc chảy trong 20 phút sau đó ngâm trong cồn 700
(lắc nhẹ trong khoảng 2 phút), rửa lại bằng nƣớc cất đã hấp thanh trùng 2-3 lần rồi khử trùng bằng Chlorin 10% trong 10 phút, rửa lại 2-3 lần bằng nƣớc cất đã hấp thanh trùng (thao tác đƣợc thực hiện trong tủ cấy). Sau khi khử trùng hạt đƣợc cấy vào môi trƣờng MS bổ sung đƣờng 20g/l. Các hạt nảy mầm vô trùng 2 ngày tuổi đƣợc chuyển vào dĩa petri với số lƣợng 20 mẫu/dĩa, đƣợc xử lý tia gamma ở các liều lƣợng 0 đến 50 Gy. Sau đó cây con đƣợc cắt lấy tử diệp và chuyển vào các thí nghiệm khảo sát môi trƣờng nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển.
Các cây mè in vitro sẽ đƣợc cấy chuyền trên môi trƣờng MS + BA 0,2 mg/l và MS + IBA 1 mg/l
2.4.2. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng cơ bản theo công thức của Murashige và Skoog, 1962 (MS) có bổ sung các vitamin (thiamin, pyridoxin, nicotinic) 1 mg/l, agar 6,0- 6,5 g/l, đƣờng sucrose 30 g/l, nƣớc dừa 100 ml/l, chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc sử dụng là BA, IBA. Tùy theo từng nghiệm thức mà bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng BA, IBA ở liều lƣợng khác nhau. pH môi trƣờng đƣợc điều chỉnh về 5,8 trƣớc khi nấu. Môi trƣờng đƣợc nấu cho tan agar sau đó rót vào keo (30ml), đậy kín bằng bọc 2 lớp đƣợc cố định bằng dây thun. Hấp thanh trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1 atm, trong 20 phút.
2.4.3. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của tia gamma và than hoạt tính lên sự sinh
trƣởng và phát triển của giống mè trắng Cần Thơ thế hệ M1V1.
Mục tiêu: nhằm xác định ảnh hƣởng của tia gamma và than hoạt tính lên sự sinh trƣởng và phát triển của giống mè trắng Cần Thơ thế hệ M1V1.
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên hai nhân tố, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3 keo, mỗi keo cấy 4 mẫu (Bảng 2.1).