Theo Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên (2002) một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trƣởng và phát sinh hình thái của mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trƣờng. Về nguyên tắc, mô thực vật nuôi cấy trong môi trƣờng cũng cần các chất dinh dƣỡng giống nhƣ cây cần dinh dƣỡng từ đất. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy. Tùy theo mục đích của ngƣời nghiên cứu mà mô cấy đƣợc duy trì ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Tuy vậy, tất cả các môi trƣờng nuôi cấy đều bao gồm các thành phần cơ bản nhƣ: nƣớc, đƣờng làm nguồn cung cấp cacbon, muối khoáng đa lƣợng, muối khoáng vi lƣợng, vitamin, chất điều hòa sinh trƣởng.
Ngoài ra, còn có thêm một số chất hữu cơ có thành phần hóa học xác định (acid amin, EDTA,…) hoặc không xác định nhƣ là nƣớc dừa. Tùy theo môi trƣờng nuôi cấy mà ta có thể bổ sung hàm lƣợng agar thích hợp (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Đƣờng: Theo Lê Trần Bình và ctv., (1997), mô và tế bào thực vật nuôi cấy
in vitro sống chủ yếu theo phƣơng thức dị dƣỡng, không có khả năng tổng hợp cacbon, nên việc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy nguồn chất hữu cơ là điều bắt buộc. Đƣờng không chỉ điều hòa áp suất thẩm thấu của môi trƣờng mà còn là nguồn carbohydrate tốt cung cấp cho mô và tế bào. Theo Nguyễn Đức Thành (2000), trong phần lớn các môi trƣờng nguồn cacbon và năng lƣợng chủ yếu là đƣờng sucrose và glucose (20-40 g/l). Nếu hàm lƣợng đƣờng cao, mô nuôi cấy khó hút đƣợc nƣớc, còn hàm lƣợng đƣờng thấp là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tƣợng thủy tinh thể (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006). Đƣờng còn có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Khoáng đa-vi lƣợng: Có nhiều nguyên tố khoáng trong môi trƣờng nuôi
cấy, mỗi nguyên tố có một vai trò riêng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Có nhiều môi trƣờng đã đƣợc thiết lập nhƣng phổ biến nhất vẫn là môi trƣờng MS (Murashige và Skoog, 1962) (George, 1996).
Theo Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn (2005), khoáng đa lƣợng rất cần cho cây, có ảnh hƣởng rất tốt cho sự hấp thu của mô cấy và không gây độc, các nguyên tố đa lƣợng đƣợc thêm vào thƣờng là Nitrogen (N), Phospho (P), Potassium (K), Magnesium (Mg), Calcium (Ca), Lƣu huỳnh (S). Khoáng vi lƣợng là những nguyên tố mà cây trồng cần rất ít nhƣng không thể thiếu cho sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng. Các vi lƣợng thƣờng thêm vào môi trƣờng là Iode (I), Bo (B), Mangan (Mn), Kẽm (Zn), Đồng (Cu), Molipden (Mo), Cobalt (Co), Sắt (Fe).
Theo Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), sắt thƣờng đƣợc bổ sung dƣới dạng chelate-EDTA vào môi trƣờng nuôi cấy.
Vitamin: Trong môi trƣờng nuôi cấy đa số mô cấy chƣa có cấu trúc tự tổng
hợp đủ lƣợng cần thiết nên phải bổ sung thêm vitamin từ môi trƣờng bên ngoài vào. Vitamin đóng vai trò là chất xúc tác trong hệ thống enzyme và chỉ cần với lƣợng nhỏ (Lê Văn Hòa và ctv., 1999). Các vitamin thƣờng đƣợc dùng ở liều lƣợng 0,1 đến 10 mg/l.
Thạch (agar): Theo Bùi Bá Bổng (1995), agar (thạch) đƣợc bào chế từ rong
biển, dùng làm chất nền cho môi trƣờng nuôi cấy vì có nguồn gốc thực vật tự nhiên, agar không độc đối với cây. Theo Nguyễn Bảo Toàn (2004), liều lƣợng agar sử dụng sẽ ảnh hƣởng đến thế năng nƣớc trong môi trƣờng nuôi cấy, độ cứng của môi trƣờng, sự sinh trƣởng của mẫu cấy, các vấn đề sinh lý của mẫu cấy nhƣ sự thừa nƣớc và sự hoạt động của cytokinin trong môi trƣờng có agar.
Tùy đối tƣợng nuôi cấy mà hàm lƣợng thạch đƣợc sử dụng dao động từ 6-8 g/l (Nguyễn Xuân Linh, 1998). Trong nuôi cấy mô dƣa hấu tam bội lƣợng agar sử dụng từ 7-9g/l để pha chế môi trƣờng và dùng keo đậy nắp lỗ thoáng khí là thích hợp tránh đƣợc hiện tƣợng đọng nƣớc trên thành bình (Đinh Thị Hƣờng, 2004).
Nƣớc dừa: Nƣớc dừa đã đƣợc xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất
khoáng và chất kích thích sinh trƣởng (George, 1996). Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010), diphenylurea (DPU) có hoạt tính giống nhƣ cytokinin là chất chính trong nƣớc dừa. Nƣớc dừa đã đƣợc sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây. Theo Hồ Thúy Diễm (2005), trong nƣớc dừa còn có các hợp chất quan trọng đối với tế bào nuôi phân lập nhƣ myo-inositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các cytokinin dạng glycoside. Nƣớc dừa đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nhằm tăng sự sinh trƣởng và phát triển của mô.
Chất điều hòa sinh trƣởng: Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành
phần quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy là các chất điều hòa sinh trƣởng. Theo Vũ Văn Vụ (1999), các chất điều hòa sinh trƣởng có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trƣởng của cây từ lúc tế bào trứng thụ tinh phát triển thành phôi cho đến hình thành các cơ quan sinh sản, ra hoa kết quả và kết thúc quá trình chu kì sống của mình. Có những loài thực vật về mặt cơ bản không cần cả auxin và cytokinin để tạo chồi bất định. Tuy nhiên, khi bổ sung auxin và cytokinin vào môi trƣờng nuôi cấy thì những chất này cũng có tác dụng lên sự tạo chồi. Hầu hết các loài thực vật đều cần đến cytokinin để cảm ứng tạo chồi, trong khi auxin thì có vai trò ngƣợc lại.
Một liều lƣợng cytokinin cao kết hợp với auxin thấp rất quan trọng trong sự tạo chồi.
Auxin: Theo Lê Trần Bình (1997), auxin đƣợc gọi là hormone sinh trƣởng
nhằm kích thích tăng trƣởng tế bào và làm tăng phân bào, Nguyễn Bảo Toàn (2010) cũng đã đề cập rằng auxin ảnh hƣởng đến quá trình hình thành phôi vô tính. Auxin còn gây ra sự mất gốc methyl của DNA trong quá trình phân chia tế bào (Okkels, 1998). Có 4 loại auxin thƣờng sử dụng trong cấy mô là Indolyacetic acid (IAA) tồn tại trong tự nhiên, Indolybutyric acid (IBA), Naphthylacetic acid (NAA), 2,4- Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) là các auxin nhân tạo. Thƣờng thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn do đặc điểm phân tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin không có tác dụng (Hồ Thúy Diễm, 2005). NAA và IBA thƣờng dùng trong việc tạo rễ và dùng phối hợp với cytokinin trong sự nhân chồi (Bùi Bá Bổng, 1995). Theo Nguyễn Văn Uyển (1993), các chất điều hòa sinh trƣởng nhóm auxin thƣờng sử dụng với liều lƣợng nằm trong khoảng 0,1-5 mg/l.
Cytokinin: Cytokinin thƣờng đƣợc dùng để kích thích sinh trƣởng và phát
triển, phổ biến nhƣ BA, kinetin và 2-iP. Hiệu quả của kích thích tố BA là rất đa dạng, vừa có khả năng tạo chồi, nhân chồi và kéo dài chồi đồng thời với liều lƣợng thấp BA có thể hỗ trợ sự thành lập rễ (Lee và ctv., 2003; Hashemloian và ctv., 2008). Tuy nhiên, sử dụng hàm lƣợng cytokinin cao có thể gây ra một số vấn đề trong các cây đƣợc nhân giống nhƣ sự thừa nƣớc, tạo thành bụi rậm, biến dị vô tính,… (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Sự tƣơng quan của auxin và cytokinin
Tỷ lệ cân đối giữa auxin và cytokinin sẽ cho phép tạo cây hoàn chỉnh. Tỷ lệ auxin cao và cytokinin thấp thích hợp cho tạo rễ, cytokinin cao và auxin thấp thích hợp cho sự tạo chồi. Mức độ trung gian của tỷ lệ này thích hợp cho sự tạo mô sẹo (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Auxin nhƣ 2,4-D, NAA, IBA kích thích sự tạo mô sẹo và giảm tạo chồi. Vì việc tạo mô sẹo trƣớc khi tạo các cơ quan là không mong muốn nên trong tạo chồi trực tiếp các auxin nhƣ 2,4-D thƣờng đƣợc sử dụng cùng với IAA và NAA. Sử dụng NAA (0,5 mg/l) hoặc NAA kết hợp với IBA (0,5-1 mg/l) đã làm cho rễ phồng lên và thân có mô sẹo ở chồi Prunus tenella, trong khi chỉ dùng IBA (0,5 mg/l) thì tạo rễ mỏng bình thƣờng và ít mô sẹo (Srivastava và ctv., 1989).
pH: Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ƣu cho sinh trƣởng và phát triển trong nuôi cấy. pH ảnh hƣởng đến sự di chuyển của các ion và đối với hầu hết các môi trƣờng nuôi cấy pH 5,5-6,0 trƣớc khi khử trùng đƣợc xem là tối ƣu. pH môi trƣờng cao hơn sẽ làm cho môi trƣờng rất rắn ngƣợc lại pH thấp hơn giảm khả năng đông đặc của agar (Lê Văn Hoàng, 2008).
Than hoạt tính: Có tác dụng khử độc, kích thích sự tăng trƣởng. Khả năng
kích thích sự tăng trƣởng của tế bào mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy. Ảnh hƣởng của than hoạt tính là hút chất cản, hút chất điều hoà sinh trƣởng thực vật trong môi trƣờng nuôi cấy hoặc làm đen môi trƣờng. Ngoài ra, than hoạt tính cho vào môi
(Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Than hoạt tính có thể chứa các thành phần kích thích nhƣ polyamin. Than hoạt tính thƣờng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy với liều lƣợng 0,5-3% (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).