2.2.1 Giai đoạn chuẩn bị vách tế bào (CW)
Men đã sử dụng từ nhà máy bia
Pha loãng đến 15% chất khô
pH = 5, Ủ ở 50oC, 24h có cánh khuấy
Gia nhiệt ở 80oC trong 15 phút
Làm nguội đến nhiệt độ phòng (26-30oC)
Ly tâm ở 3560g, 10 phút tại nhiệt độ phòng (có thể thay bằng việc lọc thông thƣờng)
Loại bỏ phần dịch trên
Thu hồi vách tế bào nấm men (CW)
Trữ ở 4oC nếu để lâu
2.2.2 Giai đoạn chuẩn bị vách tế bào đồng hoá (HCW)
Vách tế bào nấm men (CW)
Hòa tan bằng nƣớc cất đến 15% chất khô
Đồng hoá 600 bar, 6 passes
2.2.3 Giai đoạn trích ly β-glucan
Vách tế bào đồng hóa (HCW)
Trích ly trong môi trƣờng kiềm
Thêm 5 thể tích dung dịch NaOH 1N, giữ nhiệt ở 80oC trong 2h
Ly tâm ở 3565g, ở nhiệt độ phòng, 10 phút
Loại bỏ phần chất lỏng bên trên
Rửa phần còn lại bằng nƣớc cất
Ly tâm ở 3565g, nhiệt độ phòng, 10 phút Lập lại quá trình rửa tổng cộng khoảng 3 lần
Loại bỏ phần chất lỏng bên trên
Thu hồi khối rắn chứa glucan bên dƣới
Trích ly bằng môi trƣờng acid
Acid acetic 0.5N, nhiệt độ 75oC, 1h
Loại bỏ phần chất lỏng bên trên
Rửa phần còn lại bằng nƣớc cất
Ly tâm ở 3565g, 10 phút
Lập lại quá trình rửa tổng cộng khoảng 3 lần Loại bỏ phần chất lỏng bên trên
Thu hồi khối β-glucan bên dƣới (PBG) (dạng bột nhão)
2.2.4 Giai đoạn chế biến sản phẩm bột β-glucan
PBG
Hoà tan với nƣớc cất đến khoảng 7% hàm lƣợng chất khô
Bổ sung một số phụ gia nhƣ maltodextrin để tăng hiệu quả sấy phun
Sấy phun (nhiệt độ vào: 1800C, nhiệt độ ra: 85oC)
Vô bao bì, đóng gói sản phẩm dạng bột khô (SHG)
Bảo quản sản phẩm
Nguồn: (Thammakiti et al., 2004)
2.3 VAI TRÒ, ỨNG DỤNG CỦA POLYSACCHARIDE VÀ β-GLUCAN
Polysaccharide có mặt trong nhiều loại thực phẩm và vẫn giữ lại những chức năng tự nhiên của chúng nhƣ chất tạo khung (trong rau củ, trái cây), chất dinh dƣỡng (trong các hạt ngũ cốc, khoai tây,… ). Polysaccharide đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, ở cả dạng tự nhiên (native) và biến tính (modified) nhƣ các chất tạo độ đặc hay tạo gel (tinh bột, alginate, pectin, guaran gum); chất làm bền nhũ tƣơng và các hệ phân tán; chất tạo màng, bảo vệ bề mặt của các loại thực phẩm nhạy cảm khỏi những thay đổi không mong muốn; chất độn để tăng tỷ lệ thành phần không tiêu hóa đƣợc dùng trong các loại thực phẩm ăn kiêng,…
Những ứng dụng nói trên có đƣợc là do những tính chất biến đổi rất khác nhau của polysaccharide. Polysaccharide có thể không tan (cellulose), nhƣng cũng có những loại có độ trƣơng nở và hòa tan tốt trong nƣớc nóng và nƣớc lạnh (tinh bột, guaran gum). Dung dịch polysaccharide có thể có độ nhớt thấp ngay cả ở nồng độ cao (gum arabic), hay có đƣợc độ nhớt cao ở nồng độ rất thấp (guaran gum). Nhiều loại polysaccharide ở nồng độ thấp vẫn có thể tạo đƣợc các gel nhiệt thuận nghịch thermoreversible (alginate, pectin). Khi nhiệt độ tăng, các gel này sẽ bị chảy, tuy nhiên một số dẫn xuất của cellulose lại tạo gel ở nhiệt độ cao.
Nói tóm lại, polysaccharide là những chất tạo hình và tạo ra kết cấu đặc trƣng về lƣợng và về chất của nhiều loại sản phẩm thực phẩm. Do tƣơng tác với nhiệt và nƣớc, polysaccharide có thể thay đổi tính chất và trạng thái để tạo ra độ đặc, độ dẽo, độ dai, độ
dính, độ xốp, độ trong, tạo màng cho những thực phẩm khác nhau. Polysaccharide cũng tƣơng tác với những chất khác nhau để tạo cho sản phẩm các tính chất cơ lý và cảm quan nhất định (nhƣ khả năng đồng tạo gel với protein).
(Hoàng Kim Anh, 2007)
Các phức hệ polysaccarit – protein: bao gồm chủ yếu là các β-1,6-D-glucan, β-1,3-D-
glucan (Mizuno et al, 1999; Ito et al, 1997; Itoh et al, 1994), một số nghiên cứu cho rằng
bao gồm cả các β–1,4–α–D-glucan (Fujimiya et al, 1999). Các polysaccarit này có tác
dụng hoạt hoá mạnh mẽ các đại thực bào (macrophage) trong hệ thống miễn dịch của cơ thể. Các đại thực bào rất quan trọng vì chúng là hàng rào bảo vệ đầu tiên của cơ thể. Sự tăng cƣờng hoạt động của các đại thực bào đồng nghĩa với sự tăng cƣờng khả năng phòng chống, ngăn chặn các mầm mống bệnh tật ngay từ giai đoạn xâm nhập đầu tiên. Sự hoạt hoá các đại thực bào còn dẫn đến sự tăng hàm lƣợng các cytokin. Đây là các protein tối quan trọng chịu trách nhiệm xúc tác và điều hoà hàng loạt các phản ứng miễn dịch của cơ thể. Bên cạnh đó, các đại thực bào còn có các tƣơng tác với các tế bào Lympho T, có tác
dụng khởi động các phản ứng miễn dịch đặc hiệu (Mizuno et al, 1998). Vì thế, khi hoạt
động của các đại thực bào đƣợc hoạt hoá, các phản ứng đặc hiệu này cũng đƣợc tăng cƣờng. Ngoài ra, nhiều nghiên cứu còn chỉ ra rằng các polysaccarit kể trên cũng có tác dụng ức chế sự phát triển không bình thƣờng của tế bào, đặc biệt là chúng có tác dụng kích thích, làm tăng số lƣợng các tế bào lympho gây giết (killer cells) tự nhiên. Các tế bào này có khả năng phát hiện và tiêu diệt các tế bào phát triển không bình thƣờng của cơ thể, các tế bào ung thƣ. Nhƣ vậy, nhìn một cách tổng thể, các polysaccarit trong thành phần của nấm có tác dụng làm tăng cƣờng rất mạnh khả năng miễn dịch của cơ thể.
β-glucan là hỗn hợp sinh học tự nhiên bao gồm β(1-3)-glucan, β(1-6)-glucan và mannan
oligosacharide đƣợc chiết suất từ thành tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae.
- β-glucan giúp kích thích hệ miễn dịch tự nhiên: tăng cƣờng hoạt động của các đại thực bào và kích thích tăng tiết nhiều cytokines (chất hoạt hoá tế bào) nhằm tiêu diệt các mầm bệnh xâm nhập từ bên ngoài.
- β-glucan giúp giảm hệ số chuyển đổi thức ăn, kích thích tiêu hoá, phòng các bệnh đƣờng ruột, nhiễm trùng do vi khuẩn, virut.
- β-glucan là giải pháp thay thế kháng sinh trong phòng trị bệnh vật nuôi an toàn và hiệu
CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và
Sinh học ứng dụng - Trƣờng Đại học Cần Thơ.
- Thời gian: Từ ngày 02/02/2009 đến ngày 03/05/2009
3.1.2 Nguyên liệu thô
Bã men bia đã sử dụng (giống Saccharomyces cereviase), một sản phẩm phụ từ nhà máy
bia với hàm lƣợng chất khô khoảng 18%, nguyên liệu đƣợc cung cấp bởi nhà máy bia.
3.1.3 Thiết bị dụng cụ pH kế pH kế Cân phân tích Thiết bị đồng hóa Máy đo độ ẩm Waterbath Thiết bị ly tâm
Máy vô cơ và máy phân tích đạm.
Và một số thiết bị, dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm
3.1.4 Hóa chất sử dụng + NaOH + NaOH + Acid acetic + Muối chì acetat + Na2SO4 30% bão hòa + HCl + H2SO4
3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thí nghiệm sẽ đƣợc tiến hành qua các giai đoạn nhƣ sau: - Chuẩn bị vách tế bào men bia
Bã men bia từ nhà máy đem về đƣợc chia làm ba phần: phần thứ nhất sẽ tiến hành pha loãng đến 15% chất khô; phần thứ hai sẽ pha loãng đến 15% chất khô, pH = 4, ủ ở nhiệt
độ 50o
C, 24 giờ; phần thứ ba sẽ pha loãng đến 15% chất khô, pH = 5, ủ ở nhiệt độ 50oC,
24 giờ. Sau công đoạn này đem 3 phần đó đi gia nhiệt ở 80oC trong 15 phút, tiếp theo làm
nguội đến nhiệt độ phòng (26-30oC) rồi đem đi ly tâm với tốc độ là 1500 vòng/phút
khoảng 15 phút tại nhiệt độ phòng. Tiến hành loại bỏ phần dịch bên trên và thu hồi vách
tế bào nấm men bên dƣới. Đem 3 phần vách tế bào này trữ ở 4oC cho đến khi sử dụng.
- Chuẩn bị đồng hóa vách tế bào men bia
Ba phần vách tế bào men bia đƣợc khuấy đục lại trong nƣớc cất để thu đƣợc ba huyền phù bao gồm 15% hàm lƣợng chất khô. Ba huyền phù này đƣợc đem đi đồng hóa ở 300 at, 10 passes.
- Giai đoạn trích ly β-glucan
Ba loại huyền phù vách tế bào đồng hóa này đƣợc đem đi trích ly trong môi trƣờng kiềm và sau đó rửa với nƣớc cất và ly tâm (lặp lại quá trình rửa và ly tâm khoảng 3 lần cho đến khi sạch kiềm) sau quá trình này ta thu đƣợc sản phẩm là khối nhão chứa glucan.
Ta tiến hành thí nghiệm 1 là tìm tỉ lệ trích ly với NaOH 1N tốt nhất đối với 3 loại huyền
phù này ở 80oC trong 2 giờ (ta chọn tỉ lệ trích ly mà hàm lƣợng protein còn lại trong sản
phẩm thấp nhất).
Sau khi có đƣợc tỉ lệ trích ly thích hợp cho từng loại huyền phù ta tiếp tục tiến hành thí nghiệm 2 là khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ trích ly và nồng độ NaOH đến hiệu quả của quá trình trích ly kiềm đối với từng loại huyền phù ở tỉ lệ trích ly hiệu quả cho từng loại huyền phù mà ta có đƣợc ở thí nghiệm 1.
Rút ra đƣợc từ hai thí nghiệm trên ta có thể có đƣợc tất cả các yếu tố tối ƣu cần thiết để quá trình trích ly kiềm đạt hiệu quả cao nhất nhằm có thể áp dụng vào trong sản xuất.
3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát tỷ lệ trích ly với NaOH 1N ở 80oC trong thời gian 2 giờ hiệu quả đối với sản phẩm: không ủ, ủ (pH = 4) và ủ (pH = 5) hiệu quả đối với sản phẩm: không ủ, ủ (pH = 4) và ủ (pH = 5)
Mục đích: Xác định tỉ lệ trích ly với NaOH 1N ở 80oC trong thời gian 2 giờ thích hợp đối
với các sản phẩm: không ủ, ủ (pH = 4) và ủ (pH = 5) để sản phẩm có hàm lƣợng protein còn lại thấp.
Mẫu không ủ: (Thí nghiệm 1 nhân tố)
A: Tỉ lệ trích ly với NaOH 1N, 80oC, 2h (5 mức độ)
A1: tỉ lệ 1:1 A4: tỉ lệ 1:4
A2: tỉ lệ 1:2 A5: tỉ lệ 1:5
A3: tỉ lệ 1:3
Thí nghiệm lặp lại 2 lần. Tổng số thí nghiệm = 2*5 = 10 đơn vị thí nghiệm
Mẫu ủ (pH = 4): (Thí nghiệm 1 nhân tố)
B: Tỉ lệ trích ly với NaOH 1N, 80oC, 2h (5 mức độ)
B1: tỉ lệ 1:1 B4: tỉ lệ 1:4
B2: tỉ lệ 1:2 B5: tỉ lệ 1:5
B3: tỉ lệ 1:3
Thí nghiệm lặp lại 2 lần. Tổng số thí nghiệm = 2*5 = 10 đơn vị thí nghiệm
Mẫu ủ (pH = 5): (Thí nghiệm 1 nhân tố)
C: Tỉ lệ trích ly với NaOH 1N, 80oC, 2h (5 mức độ)
C1: tỉ lệ 1:1 C4: tỉ lệ 1:4
C2: tỉ lệ 1:2 C5: tỉ lệ 1:5
C3: tỉ lệ 1:3
Thí nghiệm lặp lại 2 lần. Tổng số thí nghiệm = 2*5 = 10 đơn vị thí nghiệm
Các chỉ tiêu theo dõi đo trong khối nhão: hàm lƣợng glucid tổng số và protein tổng số còn sót lại.
3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát điều kiện nhiệt độ trích ly và nồng độ NaOH hiệu quả đối với sản phẩm: không ủ, ủ (pH = 4) và ủ (pH = 5) đối với sản phẩm: không ủ, ủ (pH = 4) và ủ (pH = 5)
Chọn tỉ lệ trích ly hiệu quả cho từng loại sản phẩm: không ủ, ủ (pH = 4) và ủ (pH = 5) của thí nghiệm 1
Mục đích: Xác định nồng độ NaOH và nhiệt độ trích ly thích hợp đối với các sản phẩm: không ủ, ủ (pH = 4) và ủ (pH = 5) để sản phẩm có hàm lƣợng protein còn lại thấp.
Mẫu không ủ: (thí nghiệm 2 nhân tố) D: NaOH
D1: NaOH 0,5N D2: NaOH 1N D3: NaOH 1,5N
E: Nhiệt độ trích ly
E1: 75oC E2: 80oC E3: 85oC
Lặp lại 2 lần. Tổng số thí nghiệm: 3*3*2 = 18 đơn vị thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo sơ đồ sau:
D1 D2 D3
E1 D1E1 D2E1 D3E1
E2 D1E2 D2E2 D3E2
E3 D1E3 D2E3 D3E3
Mẫu ủ (pH = 4): (thí nghiệm 2 nhân tố)
F: NaOH
F1: NaOH 0,5N F2: NaOH 1N F3: NaOH 1,5N
G: Nhiệt độ trích ly
G1: 75oC G2: 80oC G3: 85oC
Lặp lại 2 lần. Tổng số thí nghiệm: 3*3*2 = 18 đơn vị thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo sơ đồ sau:
F1 F2 F3
G1 F1G1 F2G1 F3G1
G2 F1G2 F2G2 F3G2
Mẫu ủ (pH = 5): (thí nghiệm 2 nhân tố) H: NaOH
H1: NaOH 0,5N H2: NaOH 1N H3: NaOH 1,5N
I: Nhiệt độ trích ly
I1: 75oC I2: 80oC I3: 85oC
Lặp lại 2 lần. Tổng số thí nghiệm: 3*3*2 = 18 đơn vị thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo sơ đồ sau:
H1 H2 H3
I1 H1I1 H2I1 H3I1
I2 H1I2 H2I2 H3I2
I3 H1I3 H2I3 H3I3
Các chỉ tiêu theo dõi đo trong khối nhão: hàm lƣợng glucid tổng số và protein tổng số còn sót lại.
3.3 PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 3.3.1 Các phƣơng pháp phân tích 3.3.1 Các phƣơng pháp phân tích
3.3.1.1 Xác định hàm lượng glucid tổng theo phương pháp thủy phân bằng acid
- Nguyên tắc:
Dƣới tác dụng của acid, tinh bột (glucid tổng) bị thủy phân thành đƣờng glucose. Xác định lƣợng glucose tạo thành rồi nhân với hệ số 0,9 ta đƣợc hàm lƣợng tinh bột (glucid tổng)
(C6H10O5)n + nH2O nC6H12O6 162,1 18,02 180,12 F = 162,1/180,12 = 0,9
Phƣơng pháp xác định đƣờng khử dựa trên cơ sở trong môi trƣờng kiềm, các đƣờng khử (glucose, fructose, mantose, …) có thể dễ dàng khử đồng (II) oxit thành đồng (I) oxit
(Cu2+ Cu+), kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ gạch, qua đó tinh đƣợc lƣợng đƣờng khử.
- Hoá chất:
NaOH 30%, 10%, 1N
Pb(CH3COO)2 30%
Na2SO4 bão hòa (30%)
Metyl xanh 1%
Dung dịch fehling A: CuSO4 tinh thể 69,28g, cho nƣớc cất đến 1000ml
Dung dịch fehling B: Kali, Natri tartrate 346g, NaOH 100g, cho nƣớc cất đến 1000ml Phenolphthalein 1% trong cồn - Dụng cụ: Bình tam giác 200ml Buret Giấy lọc Phễu lọc Bếp điện - Phƣơng pháp xác định: Dung dịch thủy phân Khối lƣợng mẫu: m (g) Nƣớc cất : 50ml
HCl đậm đặc: 5ml
Thời gian thủy phân: 3 giờ
Sau khi thủy phân làm lạnh ngay. Trung hòa bằng NaOH với nồng độ giảm dần (cho vào
vài giọt phenolphtalein). Khử tạp chất bằng 7ml Pb(CH3COO)2. Để yên 5 phút đến khi
thấy xuất hiện một lớp chất lỏng trong suốt bên trên lớp cặn thì coi nhƣ đã khử tạp chất
xong. Kết tủa Pb(CH3COO)2 dƣ bằng 18-20 ml Na2SO4 hoặc Na2HPO4. Lọc và pha loãng
Cho vào bình tam giác: 5ml fehling A + 5ml fehling B + 15ml dịch lọc, đem đốt trên bếp và chuẩn độ. Mỗi lần xả 1ml dịch lọc đến khi dung dịch trong bình tam giác có màu đỏ gạch không còn ánh xanh. Thử lại bằng cách nhỏ một giọt metyl xanh vào dung dịch đang soi thấy mất màu xanh trở về màu đỏ gạch. Đọc kết quả và tra bảng tính hàm lƣợng đƣờng. Bảng 3.1: Bảng tra hàm lƣợng đƣờng ml dung dịch chuẩn đƣờng mg đƣờng khử ml dung dịch chuẩn đƣờng mg đƣờng khử ml dung dịch chuẩn đƣờng mg đƣờng khử ml dung dịch chuẩn đƣờng mg đƣờng khử 15 336 24 213,3 33 156,1 42 124,2 16 316 25 204,8 34 152,2 43 121,4 17 298 26 197,4 35 147,1 44 118,7 18 282 27 190,4 36 143,9 45 116,1 19 267 28 183,7 37 140,2 46 113,7 20 254,5 29 177,6 38 136,6 47 111,4 21 242,9 30 171,7 39 133,3 48 109,2 22 231,8 31 166,3 40 130,1 49 107,1 23 222,2 32 161,2 41 127,1 50 105,1 - Công thức tính toán: Hàm lƣợng đƣờng khử = (%) Hàm lƣợng glucid tổng = (%)
3.3.1.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Kjeldahl
Khi đun nóng mẫu có chứa nitơ (đạm) trong H2SO4 đậm đặc, với sự hiện diện của chất
xúc tác thích hợp, thì tất cả các hợp chất hữu cơ bị oxy hóa, còn NH3 đƣợc giải phóng ra
kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4.
Dùng kiềm mạnh (NaOH 30%) đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 thành ra thể tự do. NH3 tạo
thành đƣợc lôi cuốn bằng hơi nƣớc và đƣợc cất qua bình hứng có chứa dung dịch acid boric.
Số tra bảng * 0,9 * HSPL * 100
Khối lƣợng mẫu * 1000 Số tra bảng * HSPL * 100
(NH4)2SO4 + 2 NaOH = 2NH4OH + Na2SO4
NH4OH (NH4)2B4O7
Sau phản ứng định lƣợng amoni tetraborat tạo thành bằng dung dịch H2SO4 0,1N theo phản ứng sau:
(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O (NH4)2SO4 + 4H3BO3 - Tiến hành:
+ Giai đoạn vô cơ hóa mẫu
Giai đọan này cần đƣợc tiến hành trong tủ hút.
Đối với thực phẩm dạng rắn: Cân chính xác 1g mẫu cho vào ống Kjeldahl, sau đó thêm 5
ml H2SO4 đậm đặc và khoảng 0,5 gam chất xúc tác. Hỗn hợp chất xúc tác này gồm
K2SO4: CuSO4: Se (100:10:1).
Đối với thực phẩm dạng lỏng: Hút 1 ml mẫu cho vào ống Kjeldahl, sau đó thêm 5ml
H2SO4 đậm đặc và khoảng 0,5 gam chất xúc tác.