3.1.1. Ảnh hưởng của thời gian axetyl hóa đến độ deaxetyl và khả năng hòa tan của CTTN
Chitosan tan trong nước được chế tạo theo phương pháp axetyl hóa theo qui trình của Lu và cộng sự (2004) [95] nhưng có sự thay đổi tăng nồng độ chitosan. Theo Lu và cộng sự (2004) nồng độ của ion H+ có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình axetyl hóa. Khi chitosan hòa tan trong dung dịch axít, nhóm amin (-NH2) của chitosan sẽ nhận proton để tạo thành NH3+. Khi toàn bộ các nhóm -NH2 trên mạch
đại phân tử chitosan chuyển hết thành -NH3+ cùng với một lượng nhỏ ion H+ trong
dung dịch sẽ tạo lực đẩy tĩnh điện làm cho mạch chitosan duỗi ra, điều này rất thuận lợi cho quá trình axetyl hóa. Tuy nhiên, nếu lượng ion H+ quá cao dẫn đến lượng ion âm tăng lên bao quanh nhóm NH3+ làm giảm lực đẩy, khi đó mạch chitosan sẽ cuộn lại. Đó chính là lý do mà nồng độ axít 3% được lựa chọn để hòa tan chitosan.
Đồng thời để tránh sự tạo gel trong quá trình axetyl hóa chitosan được điều chỉnh
giảm KLPT cho phù hợp.
Bảng 3.1. ĐĐA của các mẫu CTTN theo thời gian axetyl hóa
Thời gian phản ứng (giờ) 0 0,5 1 2 3 5
ĐĐA(%) 89,8 67,3 56,4 49,2 48,7 47,1
Hình 3.1.ĐĐA của các mẫu CTTN theo thời gian axetyl hóa
ĐĐ
A,
%
57
Kết quả ĐĐA theo thời gian phản ứng (bảng 3.1, hình 3.1) cho thấy ĐĐA giảm nhanh sau 0,5 giờ phản ứng từ 89,8% (chitosan ban đầu) xuống 67,3% (chitosan axetyl hóa 0,5 giờ) và sau 2 giờ axetyl hóa độ deaxetyl gần như đã đạt tới giá trị không đổi khoảng 47 - 49%.
Số sóng, cm-1
Hình 3.2. Phổ hồng ngoại của mẫu chitosan ban đầu có ĐĐA = 90% (a), chitosan axetyl hóa ĐĐA là 67,3 (b), 49,2% (c) và 47,1% (d)
Kết quả từ phổ hồng ngoại (hình 3.2) cho thấy các mẫu chitosan được axetyl hóa trong thời gian 0,5; 2; 5 giờ có hầu hết tất cả các đỉnh tương tự như chitosan ban đầu, điều này chứng tỏ cấu trúc cơ bản của chitosan được axetyl hóa không thay đổi so với chitosan ban đầu, cũng như không xuất hiện nhóm chức mới trên chitosan khi thực hiện phản ứng axetyl hóa. Sự giảm ĐĐA của chitosan được axetyl hóa so với chitosan ban đầu chứng tỏ quá trình thay thế nhóm amino (-NH2) bằng nhóm axetyl amino (-NHCOCH3) đã diễn ra. Kết quả này cũng được xác nhận bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Độ h ấ p th ụ
58
Hình 3.3. Phổ cộng hưởng từ proton của chitosan
59
Cấu trúc hóa học của chitosan ban đầu và chitosan axetyl hóa cũng như độ deaxetyl được xác định thông qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Đỉnh ở 2,5-2,7 ppm ứng với 3 proton của nhóm N-axetyl glucosamin (GlcNAc), đỉnh ở 3,6-3,7 ppm ứng với proton H-2 của vòng glucosamin (GlcN) [78, 84, 85]. Proton H-3 cho đến H-6 có mật độ điện tử giống nhau trong liên kết C-H của đơn vị vòng glucosamine do có sự dịch chuyển hóa học như nhau nên gây ra sự chồng lên nhau của các đỉnh. Đỉnh rộng kéo dài ứng với các tín hiệu từ 4,1 đến 4,5 ppm thể hiện proton H-3 đến H-6. Proton H-1 có sự dịch chuyển hóa học cao nhất với tín hiệu ~ 5,1 ppm của H-1 trong nhóm GlcNAc và ~ 5,3 ppm của H-1 trong nhóm GlcN.
Nguyên nhân là do sự tác động của điện tử trên nguyên tử oxi trên vòng glucozơ và oxy trong liên kết glucozit. So sánh phổ cộng hưởng từ proton của chitosan được axetyl hóa trong hình 3.4 cho thấy không có tín hiệu mới nào được ghi nhận và các đỉnh thu được có sự dịch chuyển hóa học giống như trong mẫu chitosan ban đầu. Kết quả này một lần nữa chứng minh quá trình axetyl hóa diễn ra không làm thay đổi cấu trúc phân tử của chitosan. Độ deaxetyl tính được trong phổ cộng hưởng từ proton theo phương trình 2.2 cũng minh chứng cho quá trình axetyl hóa. Chitosan ban đầu có ĐĐA ~93% và chitosan được axetyl hóa có ĐĐA ~ 55%. Kết quả này cũng phù hợp với ĐĐA được tính bằng phổ hồng ngoại và phù hợp với các công trình đã nghiên cứu về các đặc trưng cấu trúc của chitosan [78, 84, 85].
Hình 3.5. Giản đồ nhiễu xạ tia X của CTS (a) và CTTN (b)
C ườ ng độ 2 (Độ) a b
60
Quá trình axetyl hóa diễn ra đã làm nhóm -NH2 thay đổi sự sắp xếp trật tự trong cấu trúc của chitosan, phá vỡ liên hydrogen nội phân tử và liên phân tử đồng thời làm giảm vùng kết tinh của chitosan [48, 95]. Kết quả từ giản đồ nhiễu xạ tia X của 2 mẫu chitosan và CTTN (hình 3.5) đã cho thấy rõ điều này. Trong khi giản đồ nhiễu xạ tia X của chitosan xuất hiện 2 đỉnh ở góc 2- là 10,0520, 19,6990 thì CTTN chỉ xuất hiện một đỉnh duy nhất ở góc 2- là 19,9010. Quin và cộng sự (2002) [117] cũng thu được kết quả tương tự khi chế tạo CTTN với góc 2- của chitosan là 10,40, 19,80 và cũng chỉ xuất hiện một đỉnh duy nhất ở góc 2- là 19,80 của CTTN. Đây chính là nguyên nhân giải thích cho sự hòa tan trong nước của chitosan sau khi axetyl hóa.
Ảnh hưởng của ĐĐA lên độ tan của CTTN trong nước được trình bày trong
bảng 3.2. Kết quả cho thấy chitosan được axetyl hóa trong 2 giờ tan hoàn toàn trong nước với độ tan được xác định là ~100 g/l (ở 250C), khi tăng thời gian phản ứng axetyl hóa lên 3 và 5 giờ thì khả năng hòa tan của CTTN tăng không đáng kể do đó thời gian 2 giờ được lựa chọn là thời gian thích hợp cho phản ứng axetyl hóa chitosan thành CTTN. Chitosan sau khi axetyl hóa được tủa và rửa tủa bằng cồn, CTTN thu được có màu trắng sáng (hình 3.6).
61
Bảng 3.2.Ảnh hưởng của ĐĐA lên khả năng hòa tan trong nước của CTTN
ĐĐA (%) Khả năng hòa tan Thời gian hòa tan (giờ)
67,3 56,4 49,2 48,7 47,1 Không tan Không tan Tan Tan Tan - - ~ 4 ~ 3,5 ~ 3,5
3.1.2. Ảnh hưởng của pH đến độ tan của chitosan tan trong nước
Bảng 3.3.Độ truyền qua của các mẫu CTTN 1% ở những giá trị pH khác nhau
pH 2 3 5 7 9 12
Độ truyền qua (%) 98 99 98 97 98 99
CTTN sau khi chế tạo đã được hòa tan trong nước có pH khác nhau từ 2 đến 12 để khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến độ tan. Kết quả từ bảng 3.3 cho thấy độ truyền qua của các dung dịch CTTN hầu như không đổi khi pH thay đổi. Điều này chứng tỏ CTTN tan tốt trong khoảng giá trị pH rộng (pH=2-12). Kết quả này cũng khá phù hợp với kết quả của Fan và cộng sự (2009) [48], chitosan sau khi được axetyl hóa cũng tan tốt trong khoảng pH ~ 0,6-12,7 với độ truyền qua hầu như thay đổi không đáng kể tại bước sóng 600 nm đo trên máy quang phổ UV-vis.
3.2. Đặc trưng của dung dịch vàng nano được chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ dùng CTTN làm chất ổn định xạ dùng CTTN làm chất ổn định
3.2.1. Phổ UV-Vis của dung dịch CTTN, Au3+/CTTN và dung dịch vàng nano
ổn định trong CTTN (Au/CTTN)
Các mẫu muối vàng Au3+ ban đầu có màu vàng, sau khi chiếu xạ ở các liều xạ khác nhau, màu chuyển sang màu đỏ tía (hình 3.7). Kết quả đo phổ hấp thụ UV-Vis trình bày trên hình 3.8a cho thấy các dung dịch CTTN và Au3+/CTTN trước chiếu xạ không có đỉnh hấp thụ trong vùng khả kiến. Tuy nhiên trong vùng tử ngoại, dung dịch Au3+ 0,25 mM có đỉnh hấp thụ đặc trưng tại 290 nm (max). Khi hòa tan trong
62
nước, muối clorua Au3+ phân ly thành ion AuCl4- có max trong khoảng 226-300 nm do sự chuyển điện tử giữa Au3+ với phối tử clo [19, 21, 50].
Hình 3.7.Màu của dung dịch vàng ion (a) và dung dịch vàng nano sau khi chiếu xạ (b)
Hình 3.8. Phổ UV-Vis của dung dịch CTTN, Au3+ 1 mM/CTTN 1%, Au0/CTTN (a) và dung dịch Au0/CTTN theo liều chiếu xạ (b)
Ngoài ra, theo kết quả nghiên cứu của nhiều công trình khác cũng cho thấy giá trị max của dung dịch AuCl4-/phối tử còn tùy thuộc vào loại phối tử tạo phức với AuCl4-, ví dụ như AuCl4-/citric max 310 nm [153], AuCl4-/cyanua max 316 nm [144], AuCl4-/SDS max 293 nm [21], AuCl4-/CTAC max 325 nm [114],.. .
Dung dịch vàng nano có đỉnh hấp thụ tại max~522 nm, đây là đỉnh hấp thụ cộng hưởng plasmon bề mặt đặc trưng của vàng nano do sự dao động cộng hưởng giữa photon ánh sáng tới với electron vùng dẫn của vàng nano, hiện tượng này không có đối với vàng khối [100, 157].
CTTN Au3+/CTTN Au0/CTTN a b Bước sóng, nm C ườ ng độ h ấ p t h ụ Bước sóng, nm C ườ ng độ h ấ p t h ụ a b
63
Hình 3.9. Cường độ hấp thụ của dung dịch vàng nano/CTTN theo liều xạ (Au3+ 1 mM/ CTTN 1% pha loãng bằng nước 1/10)
Kết quả phổ hấp thụ của dung dịch Au3+ 1 mM/CTTN 1% theo liều chiếu xạ (hình 3.8b) cho thấy, mật độ quang (OD) ở max ~522 nm tăng dần theo liều xạ và đạt giá trị ổn định trong khoảng liều 6-8 kGy (hình 3.9). Như vậy, khi chiếu xạ dung dịch Au3+ 1 mM /CTTN 1% đạt liều hấp thụ 6-8 kGy đã chuyển hóa hoàn toàn Au3+ thành Auo bởi tác nhân khử là e–aq, H và gốc tự do CTTN sinh ra trong quá trình chiếu xạ và liều 8 kGy được gọi là liều xạ chuyển hóa bão hòa [16, 20, 63, 124]. Giá trị này cũng tương đối phù hợp với tính toán lý thuyết về hiệu suất khử Au3+ thành Auo bằng bức xạ, để khử hoàn toàn 1 mM Au3+ cần liều xạ 6 kGy [16].
Trong quá trình chế tạo dung dịch keo kim loại nano (Ag, Au,..) bằng phương pháp chiếu xạ, thường các chất có khả năng bắt gốc tự do OH như là các ancol cần
được bổ sung vào dung dịch trước khi chiếu xạ, do OH có tính oxi hóa kim loại
thành ion kim loại nên gây ảnh hưởng đến sự hình thành và ổn định kích thước hạt kim loại nano. Tuy nhiên, theo kết quả nghiên cứu về khả năng chống oxi hóa của chitosan cắt mạch bởi bức xạ gamma Co-60 của nhóm tác giả Feng và cộng sự (2008) [49] cho thấy các nhóm hydroxyl và nhóm amin trên mạch chitosan có khả năng phản ứng với các gốc tự do (OH) chuyển hóa thành gốc tự do đại phân tử CTS, các gốc tự do này có thể khử Ag+, Au3+ đến hóa trị thấp hơn.
Liều xạ, kGy C ườ ng độ h ấ p t h ụ
64
Ngoài ra, trên các nhóm hydroxyl (–OH), amin (–NH2) và nhóm aminoaxetyl (-NHCOCH3) trong mạch CTTN còn các cặp electron tự do chưa tham gia liên kết nên có khả năng tạo phức với các kim loại. Do vậy, CTTN được sử dụng đồng thời như là chất khử, chất bắt gốc tự do và chất ổn định dung dịch vàng và bạc nano [4, 28, 42, 47, 66, 106, 136]. Hiệu ứng bắt gốc tự do OH của protein hoặc các polysacarit khác như alginat [20], tinh bột [71], gum arabic [150],.. trong quá trình khử Au3+ thành dung dịch vàng nano bằng bức xạ gamma cũng đã được minh chứng [4, 16, 20, 63]. Trên cơ sở đó, các mẫu dung dịch vàng nano/CTTN chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60 của luận án này không sử dụng chất khử hóa học và không bổ sung thêm chất bắt gốc tự do OH.
3.2.2. Ảnh TEM và sự phân bố kích thuớc hạt của dung dịch vàng nano dùng CTTN làm chất ổn định
Qua sự thay đổi về màu sắc của dung dịch ion trước và sau khi chiếu xạ cùng với phổ đồ UV và ảnh TEM thu được có thể kết luận rằng quá trình khử ion Au3+ thành Auo đã diễn ra. Các nguyên tử vàng vừa tạo thành nhanh chóng kết hợp với nhau để tạo thành cụm (cluster) và tiếp tục phát triển thành hạt lớn hơn. Cơ chế khử Au3+ về vàng nano đã được trình bày trong chương 1 (mục 1.1.13.2).
Hình 3.10.Ảnh TEM và sự phân bố kích thước hạt của dung dịch vàng nano (Au 0,1 mM/CTTN 1%) 0 10 20 30 40 50 2 4 6 8 10 12 dtb, nm T ầ n s ố , % 4,58 ± 0,63 nm
65
So với các công trình chế tạo dung dịch vàng nano bằng phương pháp chiếu xạ đã được công bố thì tính mới, tính sáng tạo của luận án được thể hiện ở việc chế tạo và sử dụng CTTN, một polime tự nhiên với những tính chất đáng quý như: tính phân hủy sinh học, tương hợp sinh học và không gây độc môi trường [83, 115], có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa, chống ung thư, tăng miễn dịch [116, 159], có hiệu ứng kích kháng bệnh thực vật (elicitor) [3, 68, 95, 152] và đặc biệt có khả năng tan trong nước trong khoảng pH rộng (pH= 2-12), đã được sử dụng với vai trò đồng thời vừa là chất bắt gốc tự do vừa là chất ổn định kích thước hạt vàng nano. Trong mạch của CTTN có chứa nhiều nhóm chức giàu điện tử như nhóm amin (-NH2), aminoaxetyl (-NHCOCH3) và nhóm hydroxyl (-OH). Nhờ vậy, hạt vàng tạo thành trong dung dịch được bảo vệ bởi các nhóm chức giàu điện tử và hiệu ứng ức chế không gian do đó kích thước vàng nano được ổn định. Điều này thể hiện trong ảnh TEM của mẫu Au3+ 0,1 mM/CTTN 1% với kích thước hạt trung bình 4,58 ± 0,63 nm với sự phân bố kích thước hạt theo kiểu hình chuông (hình 3.10).
3.2.3. Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) của dung dịch vàng nano dùng CTTN làm chất ổn định
Kết quả từ giản đồ nhiễu xạ tia X minh chứng sự tồn tại cấu trúc hạt vàng nano trong dung dịch vàng thu được bằng phương pháp chiếu xạ dùng CTTN làm chất ổn định. Trong khi giản đồ XRD của CTTN (hình 3.5b) chỉ có đỉnh hấp phụ tại góc 2- theta là 200 của CTTN thì dung dịch vàng nano được ổn đinh bằng CTTN (hình 3.11) lại xuất hiện đỉnh trong phổ đồ tại 38,20; 44,60; 64,70 và 77,80 tương ứng mặt tâm thể 111, 200, 220 và 311 của hạt vàng nano có cấu trúc hình lập phương tâm khối (face centered cubic – fcc) [63, 67].
66
Hình 3.11. Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) của vàng nano/CTTN
Huang và cộng sự (2007) [67] dùng tia UV chế tạo vàng nano ổn định trong cacboxylmetylchitosan (CMC) cũng ghi nhận các góc 2θ thu được từ giản đồ nhiễu xạ tia X là 38,20; 44,30; 64,50; và 77,60 tương ứng với mặt tâm thể 111, 200, 220, 311 của vàng nano. Kết quả này cũng tương đồng với nhiều công trình khác khi chế tạo vàng nano bằng các phương pháp khác nhau [22, 40, 63, 67, 89].
3.2.4. Phổ hồng ngoại của của dung dịch vàng nano dùng CTTN làm chất ổn
định
Để minh chứng sự liên kết giữa chất ổn định (CTTN) và vàng nano, phổ hồng ngoại của CTTN và của dung dịch vàng nano được ổn định trong CTTN đã được đo trong khoảng bước sóng từ 400 - 4000 cm-1 và thể hiện trong hình 3.12. Kết quả từ phổ hồng ngoại của mẫu CTTN (hình 3.12a) thể hiện các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho các nhóm chức như sau: 3445 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm - OH, 2933 cm-1 và 2885 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị bất đối xứng và đối xứng của nhóm -CH2, 1658 cm-1 đặc trưng cho dao động biến dạng của liên kết CO- NH, 1554 cm-1 đặc trưng cho dao động của nhóm -NH, 1442 cm-1 đặc trưng cho dao
động cộng hưởng của liên kết C-N và N-H, 1070 cm-1 đặc trưng cho dao động của
nhóm C-OH của ancol bậc hai và 1031 cm-1 đặc trưng cho dao động của nhóm C- OH của ancol bậc một, 897 cm-1 là dao động của vòng glucozit [84].
C
ườ
ng
độ
67
Hình 3.12. Phổ hồng ngoại của mẫu CTTN (a) và vàng nano/CTTN (b)
Phổ hồng ngoại của dung dịch vàng nano được ổn định trong CTTN được thể hiện trong hình 3.12b. Kết quả cho thấy có sự thay đổi về cường độ và sự dịch chuyển bước sóng tại một vài đỉnh hấp thụ cụ thể là: cường độ hấp thụ đặc trưng cho nhóm -OH trong dung dịch vàng nano nhỏ hơn trong dung dịch CTTN và có sự dịch chuyển bước sóng từ 3455 cm-1 (CTTN) sang 3408 cm-1 (vàng nano/CTTN). Tương tự, có sự giảm cường độ hấp thụ tại bước sóng đặc trưng cho dao động của liên kết CO-NH và -NH, cùng với đó là sự dịch chuyển bước sóng từ 1659 cm-1