Vàng là một vật liệu cho nhiều ứng dụng quan trọng trong y học có lịch sửđã hàng ngàn năm. Từ thời Trung cổ và Ai Cập cổđại đã sử dụng dung dịch vàng để điều trị các bệnh khớp và dung dịch vàng được xem như là thần dược chống lão hóa [17, 31]. Hiện nay, dung dịch vàng chủ yếu ở dạng dung dịch keo được sử dụng làm chất phát quang, hấp thụ sóng điện tử ứng dụng trong y sinh. Ngoài ra, cũng như hạt nano bán dẫn, bề mặt hạt vàng nano có thể kết hợp với phân tử thuốc, phân tử sinh học như DNA, các loại protein như enzym, kháng thể,.. để dò tìm tế bào ung thư, hoặc được phủ một lớp thuốc đặc trị để tiêu diệt các tế bào ung thư đồng thời có thể mang các hoạt chất giúp chuẩn đoán bệnh chính xác hơn [17, 34, 52, 73, 156].
Hình 1.18. Hạt vàng nano và các chất tạo nhóm chức khác nhau [156]
Không giống như dạng vàng khối (bulk), hạt vàng nano dễ bị oxi hóa bề mặt tạo cụm vàng ion (ion cluster) và vàng nano ái lực cao với các phân tử chứa nhóm chức như thiol (–SH), amin (–NH2), cacboxyl (–COO–), hydroxyl (–OH),.. [33, 58, 156]. Dựa trên các đặc trưng tính chất hóa – lý – sinh học đặc thù của hạt vàng nano, nhiều công trình nghiên cứu chức năng hóa bề mặt hạt vàng nano với các hoạt chất, dược chất để ứng dụng cho nhiều mục đích khác nhau đặc biệt là ứng dụng trong lĩnh vực sinh y học (hình 1.18). Hamaguchi và cộng sự [58] sử dụng vàng
36
nano/glycin như là một cảm biến phát hiện ion kim loại nặng trong dung dịch ở mức độM bằng cách đo phổ UV-Vis. Boisselier và Astruc [31] đã xác định dùng vàng nano/folat làm gia tăng khả năng hấp thụ vàng nano lên tế bào ung thư cao hơn 6 lần so với tế bào thường, ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thư.
Một ưu điểm nổi bật khác là hạt vàng nano được chức năng hóa bề mặt có thể hấp thụ đặc hiệu lên các mô tế bào và cho kết quả hiển thị rõ ràng. Hơn nữa, hạt vàng nano còn phân biệt tế bào ung thư và tế bào khỏe mạnh bằng sự khác nhau của bước sóng hấp thụ và có thể chuẩn đoán và điều trị bệnh ung thưở những giai đoạn đầu, từđó giảm những di căn nguy hiểm và tăng khả năng thành công của quá trình điều trị [69, 98] (hình 1.19).
Hình 1.19.Hạt vàng nano giúp chẩn đoán và điều trị ung thư [69, 87]
Hạt tải thuốc nano sẽ được kết hợp ở vỏ hoặc được chứa bên trong hạt. Khi được đưa vào cơ thể, hạt tải thuốc nano sẽ theo hệ thống tuần hoàn qua mạch máu đểđi đến mục tiêu. Kích cỡ của hạt nano là một yếu tố quan trọng cho việc tải thuốc. Kích cỡ này phải trong phạm vi từ 4 đến 400 nm. Nếu nhỏ hơn 4 nm hạt sẽ nhanh chóng bị thải ra theo con đường bài tiết. Nếu lớn hơn 400 nm hạt sẽ bị hệ thống miễn dịch phát hiện và loại ra trừ ra khỏi cơ thể [26, 31, 52, 76]. Như vậy, dược liệu được bao lại trong từng “gói nhỏ” và di chuyển đến mục tiêu để “bắn phá” tế bào ung thư. Phân tử thuốc có thểđi xuyên qua vách tế bào bởi sự thẩm thấu và khuyếch tán do vậy cả tế bào lành và tế bào ung thư đều bị tiêu diệt. Tuy nhiên, khi thuốc được gói trong các hạt tải nano, độ lớn của hạt không cho nó di chuyển qua vách huyết quản của tế bào lành nhưng có thể chui lọt qua những khoảng hở của tế bào ung thư từ đó đi vào khối u và tiêu diệt những tế bào ung thư mà không làm ảnh
37
hưởng những tế bào lành bên cạnh [69, 87]. Hoạt tính enzym oxi hóa glucose tăng 1,4 lần khi được gắn với vàng nano [120] do vàng nano có khả năng làm tăng tốc độ truyền điện tử từ enzym đến cơ chất và vàng nano làm tăng hoạt tính bắt gốc tự do của vitamin E lên khoảng 8 lần [105]. Hạt vàng nano được biến tính bề mặt với phối tử axít mercaptundecanoic rồi gắn với thuốc điều trị ung thư là cis-Pt(NH3)2Cl để mang và ly giải thuốc đến mục tiêu cần điều trị [156]. Do hạt vàng nano hấp thụ mạnh năng lượng bức xạ [98] và chuyển hoá thành nhiệt đồng thời một phần phát quang nên nhóm tác giả Paasonen và cộng sự [108] đã nghiên cứu đưa vàng nano vào trung tâm của milcel có cấu trúc liposome có chứa calcein, kết quả làm tăng khả năng ly giải calcein từ liposome lên hơn 100 lần. Lee và cộng sự [87] đã nghiên cứu biến tính gắn các enzym như heparinase, hyaluronidase và chất phát huỳnh quang lên hạt vàng nano đểứng dụng chẩn đoán phát hiện ung thư di căn (hình 1.20).
Hình 1.20.Hạt vàng nano mang thuốc đến các tế bào ung thư [98, 111]
Vàng nano có ái lực liên kết với kháng thể nên một số công trình nghiên cứu biến tính bề mặt hạt vàng nano với các kháng thể đặc hiệu để phát hiện và điều trị bệnh ung thư [44] và chẩn đoán, điều trị các bệnh do virus [110]. Ngoài ra, vàng nano còn được ghi nhận có tính năng gia tăng sự sinh sản tế bào gan khi được biến tính gắn với axít amin là cysteamin rồi bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào gan, ứng dụng trong kỹ thuật sản xuất gan nhân tạo [54]. Vàng nano sau khi cải biến bề mặt với các kháng nguyên, kháng thể, dược chất và chất phát quang đã được ứng dụng làm cảm biến sinh học, chất điều trị ung thư, trị bệnh mất trí (alzheimer),
Au nano-DNA ứng dụng mang thuốc đến tế bào ung thư
Tế bào
ung thư DNA gắn
thuốc trị
38
bệnh HIV, bệnh gan, đái tháo đường,.. và bệnh thấp khớp. Vàng nano biến tính còn có hiệu ứng diệt khuẩn và hiệu ứng làm lành vết thương [31].
1.3.4.2. Ứng dụng vàng nano xác định hàm lượng melamin trong sữa
Melamin là hợp chất hữu cơ, công thức hóa học là C3H6N6 (1,3,5-triazin- 2 ,4,6-triamin), màu trắng, dạng bột tinh thể tan rất ít trong nước [34]. Melamine được biết đến như một chất gây hại nếu nuốt, hít và có thể hấp thụ qua da. Trẻ uống sữa trộn melamine kéo dài sẽ bị thiếu dinh dưỡng, nhưng tệ hại hơn là chất độc melamine sẽ tích tụ qua từng ngày, lắng đọng và gây hại cho cơ thể. Một phương pháp tin cậy để xác định dư lượng melamin trong thực phẩm và đặc biệt trong các sản phẩm sữa cho trẻ em là rất cần thiết. Dung dịch vàng nano được sử dụng để xác định dư lượng melamin bằng phương pháp đo màu đang thu hút sự quan tâm vì tính đơn giản, dễ quan sát bằng mắt thường và không yêu cầu các thiết bị phức tạp.
Nguyên tắc của bộ cảm biến đo màu xác định hàm lượng melamin bằng vàng nano được minh họa trong hình 1.21. Nhóm amin trong melamin là một nhóm tích điện dương sẽ tạo liên kết với điện tích âm trên bề mặt của các hạt vàng nano khác thông qua tương tác tĩnh điện.
Hình 1.21. Cơ chế phát hiện melamin trong sữa bằng dung dịch vàng nano vàng nano/chitosan (a), vàng nano/chitosan + 1×10-3 g/l melamin (b), vàng
nano/chitosan + 5×10-3 g/l melamin và ảnh TEM [55]
Sau khi melamin được cho vào dung dịch vàng nano quá trình keo tụ nhanh chóng xảy ra, kích thước hạt vàng lớn lên và màu của dung dịch vàng nano chuyển từ màu đỏ tía sang màu tím và màu xanh đen tùy thuộc vào hàm lượng melamin cho
39
vào (hình 1.22). Thông qua sự thay đổi màu sắc của dung dịch vàng nano khi có mặt melamin có thể dễ dàng định tính melamin trong sữa cũng như trong các sản phẩm công nghiệp.
Hình 1.22. Sự thay đổi màu sắc của dung dịch vàng nano sau khi cho melamin ở
các nồng độ khác nhau [55]
Để định lượng hàm lượng melamin trong sữa phương pháp đo UV-Vis được sử dụng để xây dựng đường chuẩn bằng cách cho melamin vào dung dịch vàng nano ở các nồng độ khác nhau.
Hình 1.23. Phổ UV-Vis của vàng nano và vàng nano + melamin (a) và đường chuẩn định lượng hàm lượng melamin (b) [55]
Kết quả trong hình 1.22 và hình 1.23 cho thấy khi tăng nồng độ melamin làm tăng quá trình keo tụ và tăng kích thước hạt vàng, cùng với đó là sự giảm cường độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm (A520) và tăng cường độ hấp thụ ở bước sóng 650 nm (A650) do đó làm tăng tỉ lệ hấp thụ A650/A520. Guan và cộng sự (2013) [55] nhận thấy tỉ lệ A650/A520 có mối tương quan tuyến tính với nồng độ của melamin trong khoảng nồng độ 10-2 đến 10-5 g/l (R=0.996, hình 1.24). Do đó tỷ lệ này đã được sử dụng để xây dựng đường chuẩn với giới hạn phát hiện (LOD) melamin là 6×10-6 g/l thấp hơn nhiều so với quy định hàm lượng melamin an toàn trong sữa là 0,15 mg/l đối với sữa bột trẻ em [34, 55, 65, 91]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
40
Các kết quả trên cho thấy melamin dễ dàng được phát hiện và định lượng thông qua sự biến đổi màu sắc của dung dịch vàng nano. Dung dịch vàng nano được sử dụng như một cảm biến đo màu cho phép xác định hàm lượng melamin nhanh chóng (khoảng 20 phút tính cả thời gian chuẩn bị mẫu), hiệu quả, ít tốn kém và không yêu cầu những thiết bị phân tích phức tạp.
1.3.4.3. Ứng dụng của dung dịch vàng nano trong xúc tác
Vàng là kim loại rất được các nhà kim hoàn ưa chuộng vì đặc tính không bị oxi hóa. Nhưng ở kích thước nano, đặc tính này đã hoàn toàn thay đổi. Từ cuối những năm của thập niên 80 thế kỉ XX, một nhóm các nhà khoa học Nhật Bản đã chứng minh phân tử vàng có kích thước nhỏ hơn 5 nm có thể tham gia phản ứng oxi hóa với cacbonmonoxit (CO) để tạo thành CO2. Các nhà nghiên cứu đã kết hợp hạt vàng nano với hạt đồng nano để tạo thành thể lai, giúp xúc tác cho việc giảm thiểu CO2 [60, 61, 80, 93].
Đồng là một trong những kim loại có thể biến CO2 thành nhiên liệu hydrocacbon năng lượng thấp. Khi được đưa vào một điện cực có dòng điện kích thích, đồng hoạt động như một chất xúc tác mạnh, tạo ra một phản ứng điện hóa với CO2, biến khí nhà kính này thành metan hoặc metanol. Nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới đã nghiên cứu tiềm năng này của đồng để tạo ra một phương pháp tái chế hiệu quả khí CO2 thải từ nhà máy điện. Thay vì thải ra ngoài không khí, CO2 sẽ được truyền qua một chất xúc tác đồng và trở thành khí metan [60, 61, 72].Tuy nhiên, đồng dễ dàng bị oxy hoá, là kim loại không ổn định nên có thể làm chậm đáng kể phản ứng với CO2 và tạo ra các sản phẩm phụ không mong muốn như CO và axít fomic. Hiện nay, các nhà nghiên cứu tại Viện Kỹ thuật Massachuset đã đưa ra một giải pháp có thể làm giảm năng lượng cần thiết để đồng chuyển hóa CO2, đồng thời làm cho kim loại này ổn định hơn nhiều. Nhóm nghiên cứu đã tạo ra các hạt đồng nano rất nhỏ trộn với hạt vàng nano, có khả năng chống ăn mòn. Trong thí nghiệm, họ đã phủ các hạt lai này lên các điện cực và thấy rằng để phản ứng với CO2 các hạt này cần ít năng lượng hơn các hạt nano đồng nguyên chất [76]. Ngoài
41
ra vàng có thể tham gia phản ứng ở nhiệt độ thấp (-700) trong khi đó một số chất xúc tác khác như Platin chỉ phản ứng ở trên 100 oC [60, 61, 80, 93].
1.3.5.4. Ứng dụng của dung dịch vàng nano trong mỹ phẩm
Dung dịch vàng nano đã được đánh giá là an toàn và tương hợp sinh học [44, 69, 105]. Độc tính của dung dịch vàng nano phụ thuộc chủ yếu vào kích thước hạt. Nghiên cứu độc tính tế bào của dung dịch vàng nano còn nhiều kết quả chưa thống nhất nhưng phần lớn kết luận là hạt vàng có kích thước nhỏ hơn 2 nm hoặc lớn hơn 20 nm thì gây độc tế bào cao hơn khoảng kích thước khác, nguyên nhân do khả năng thâm nhập và mức độ đào thải của vàng nano kích thước khác nhau bởi hệ thống cơ thể [26, 31, 38, 76, 109, 144].
Hình 1.24.Sản phẩm kem dưỡng có chứa vàng nano [101]
Kem dưỡng ẩm mặt bao gồm nhiều thành phần, trong đó có chứa những hạt vàng nano có kích thước trung bình 10-15 nm hoặc nhỏ hơn (hình 1.24). Chiều dài trung bình tế bào người là 10 micromet (lớn gấp 2500 lần so với kích thước nano). Do đó, hạt vàng nano dễ dàng thấm sâu vào da hoặc những tế bào dưới da một cách nhánh chóng [101]. Đây là môi trường diễn ra sự cải thiện và tái tạo các tế bào mới. Sự phân chia tế bào đòi hỏi nguồn năng lượng được tạo ra một cách tự nhiên gồm những xung điện cực nhỏ. Do đó, vàng nano trở nên hữu dụng trong trường hợp này vì nó là chất dẫn điện tốt không độc, khả năng tương hợp sinh học cao và diện tích bề mặt hạt lớn cho hiệu quả tối ưu [67, 68, 101, 105, 138].
Ngoài ra, theo các tài liệu y khoa, vàng có thể đẩy mạnh hệ miễn dịch khiến da tươi sáng, tóc bóng mượt và giúp ngăn chặn lão hóa. Vàng có thể thẩm thấu đến 99% vào lớp tế bào đáy giúp kích thích sản sinh những tế bào khoẻ mạnh làm chậm
42
quá trình lão hoá của collagen và elastin. Vì vậy, ngăn ngừa được tình trạng da bị chảy xệ, làm sáng da qua việc làm chậm sự sản sinh melanin, phục hồi nét thanh xuân, giúp da tươi trẻ và rạng rỡ. Khoa học đã chứng minh các gốc tự do là nguyên nhân gây ra lão hoá, và chỉ có chất chống oxy hoá mới “vô hiệu hoá” được chúng. Do nhiều nguyên nhân, cơ thể con người sản sinh ra nhiều chất peroxit và gốc tự do. Vàng có tính chống oxi hóa mạnh, vì vậy làm giảm oxy hoá và gốc tự do ngay từ bên trong cơ thể ra bên ngoài, giúp trẻ hoá da hiệu quả. Kem chứa vàng nano có tác dụng tối ưu khả năng hydrat hóa, tái tạo tế bào da mới như khi còn trẻ bằng cách kích thích chất tạo keo cũng như các sản phẩm tạo độđàn hồi cho da [101, 105].
43
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất
- Muối vàng HAuCl4.3H2O, etanol (C2H5OH), gum arabic, hydroxyetylxenlulozơ
(HEC), polyvinyl pyrrolidon (PVP), anhydrit axetic (CH3CO)2O, nước tinh khiết, Merk, Đức
- Chitosan (CTS) có độđề axetyl (ĐĐA) ~90%, khối lượng phân tử trung bình (Mw) 168.000 g/mol là sản phẩm của Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ
Bức xạ.
- Axít lactic loại tinh khiết, hãng Shanghai Chemical Co., Trung Quốc. - Các hóa chất khác: dạng tinh khiết.
2.2. Thiết bị, dụng cụ
- Nguồn chiếu xạ gamma Co-60, SVST Co-60/B, Hungary, suất liều ~1,33 kGy/giờ
tại Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ, Tp. HCM.
- Nguồn Gamma Chamber 5000, BRIT, Ấn độ, suất liều ~ 5,0 kGy/giờ tại Viện Nghiên cứu Hạt nhân, Đà Lạt.
- Máy đo quang phổ UV-Vis, UV-2401PC, Shimadzu, Nhật Bản tại Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ, Tp. HCM.
- Máy đo phổ hồng ngoại FTIR- 8400S, SHIMADZU, Nhật bản tại Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ, Tp. HCM.
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 MHz, Đức tại trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp. HCM. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Máy sắc ký gel (GPC) 110, detector RI, Agilent (Mỹ) ở nhiệt độ 30 0C, sử dụng cột 250 và 500 Utrahydrogel của hãng Waters. Dung môi 0,25 M CH3COOH/ 0,25 M CH3COONa. Mẫu chuẩn là Pullulan có Mw từ 780 đến 380.000 Da.
- Máy chụp ảnh hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscopy- TEM), JEM1010, JEOL, Nhật bản tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội. - Máy đo nhiễu xạ tia X: Advance 8-Bruker, Germany tại Viện Khoa học Vật liệu
44
2.3. Phương pháp thực nghiệm
2.3.1. Điều chế chitosan tan trong nước
Hình 2.1.Sơđồ tóm tắt qui trình chế tạo chitosan tan trong nước
2.3.1.1. Xác định ĐĐA (%) của chitosan và CTTN
Để phân biệt chitin và chitosan khái niệm độ deaxetyl hoặc độ axetyl (ĐA = 100 – ĐĐA) đã được sử dụng, thực chất là sự khác nhau về hàm lượng của nhóm - NHCOCH3 và nhóm -NH2 trong chitin và chitosan.
Có nhiều phương pháp để xác định độ deaxetyl như dùng phương pháp chuẩn
độ, phổ 1H-NMR, phổ hồng ngoại, phổ UV,.. . Trong luận án này độ deaxetyl được xác định thông qua phổ hồng ngoại (IR) với kỹ thuật ép viên KBr và phổ cộng