Khả năng sinh trưởng của 4 dòng nấm men ở các mức độ nhiệt độ khác nhau qua 1 – 4 ngày ủ được thể hiện qua Bảng 3.
Bảng 3. Khả năng chịu nhiệt của 4 dòng nấm men
STT Dòng nấm men Nhiệt độ khảo sát 40°C 42°C 43°C 45°C 47°C 49°C 1 L29–1 + + + – – – 2 L07–1 + + + + – – 3 P4 + + + – – – 4 L2b2 + + + + – –
Ghi chú: Dấu “+” có khuẩn lạc, dấu “–” không có khuẩn lạc
Sau 48 giờ cấy nấm men vào môi trường dinh dưỡng tất cả 4 dòng nấm men đều cho thấy khuẩn lạc phát triển ở các mức nhiệt độ 40, 42 và 43°C. Ở nhiệt độ 45°C có 2 dòng phát triển được là L07–1 và L2b2. Ở mức nhiệt độ 47°C và 49°C không có dòng nấm men nào có thể chịu đựng và phát triển để tạo khuẩn lạc sau 48 giờ ủ. Trong thí nghiệm này khi tăng nhiệt độ ủ lên càng cao thì khả năng tồn tại và phát triển của các dòng nấm men càng giảm xuống.
Kết quả thí nghiệm trên đã giúp chúng ta đánh giá được sơ bộ khả năng chịu nhiệt của 4 dòng nấm men. Cả 4 dòng đều phát triển ở nhiệt độ 43°C, ở nhiệt độ 45°C chỉ có 2 dòng phát triển và hình thành khuẩn lạc được là L07–1 và L2b2.
So sánh với khả năng chịu nhiệt của các dòng nấm men Thái Lan ( Nguyễn Ánh Dương, 2013) ta thấy những dòng nấm men này có khả năng phát triển ở nhiệt độ rất cao ( 45°C) nhiệt độ mà ít có dòng nấm men có khả năng chịu đựng được.
Đồng thời, khi so sánh khả năng phát triển ở nhiệt độ cao của nấm mem Lào với các dòng nấm men phân lập ở Việt Nam ( Nguyễn Hữu Tường, 2013) thấy rằng các dòng nấm men Lào chịu được nhiệt độ cao hơn các dòng nấm men phân lập ở Việt Nam ( chỉ phát triển được ở 43°C).
4.2. Khả năng chịu ethanol của 4 dòng nấm men
Khả năng sinh trưởng của 4 dòng nấm men ở môi trường có bổ sung nồng độ ethanol khác nhau sau 48 giờ ủ được thể hiện ở Bảng 4.
Bảng 4. Khả năng chịu ethanol của 4 dòng nấm men sau 48 giờ ủ
STT Dòng nấm men Nồng độ ethanol khảo sát
4% 8% 10% 12% 14% 15%
1 L29–1 + + + + + +
2 L07–1 + + + + + +
3 P4 + + + + + –
4 L2b2 + + + + + +
Ghi chú: Dấu “+” có khuẩn lạc,” –” không có khuẩn lạc
Sau 48 giờ cấy nấm men trong môi trường dinh dưỡng, tất cả các dòng nấm men đều phát triển trong môi trường có bổ sung 4, 8, 10, 12 và 14% ethanol. Ở mức 15% ethanol có 3 dòng có thể phát triển được và tạo khuẩn lạc là L29–1, L07–1 và L2b2. Nhìn chung 4 dòng nấm men này có khả năng chịu ethanol tương đối cao, chỉ có dòng P4 không phát triển ở nồng độ ethanol 15%. Khả năng chịu ethanol của các dòng nấm men cũng được xem là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng phát triển của các dòng nấm men, khi nồng độ ethanol quá cao sẽ ức chế sự phát triển và gây ngộ độc nấm men.
Thí nghiệm khảo sát khả năng chịu ethanol giúp đánh giá sơ bộ khả năng chịu ethanol của 4 dòng nấm men. Tất cả 4 dòng nấm men đều phát triển ở nồng độ ethanol bổ sung 4, 8, 10, 12, 14% và có 3 dòng phát triển ở nồng độ ethanol bổ sung 15% là L29–1, L07–1 và L2b2. L2b2 P4 15 % L07-1 L29-1 15% Hình 7. Khuẩn lạc của dòng L2b2, L07-1 và L29-1 ở môi trƣờng bổ sung 15% ethanol
So sánh khả năng chịu ethanol của các dòng nấm men Lào với Thái Lan ( Nguyễn Ánh Dương, 2013) và Việt Nam ( Nguyễn Hữu Tường, 2013) thấy rằng những dòng nấm men Lào Và Thái có khả năng chịu được nồng độ ethanol cao (15%) trong khi đó các dòng nấm men phân lập ở Việt Nam chịu được nồng độ ethanol thấp hơn ( chỉ 12%).
4.3. Khả năng lên men đƣờng glucose của các dòng nấm men
Kết quả chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong ống thủy tinh úp ngược ở các thời điểm 4, 8, 12, 16, 20 và 24 giờ được thể hiện trong Bảng 5.
Bảng 5. Khả năng lên men glucose của các dòng nấm men
STT Dòng nấm men Thời gian xuất hiện bọt khí Chiều cao cột khí CO2 (mm)
4 giờ 8 giờ 12 giờ 16 giờ 20 giờ 24 giờ 1 L29–1 2 3,67b 13,00b 18,00b 24,00c 26,33b 27,33b 2 L07–1 2 3,00b 15,00b 26,00a 27,67b 28,67a 30,00a 3 P4 2 15,33a 19,67a 28,67a 28,67ab 28,67a 28,67ab 4 L2b2 2 4,67b 17,67a 28,67a 30,00a 30,00a 30,00a
Ghi chú: Chiều cao tối đa của cột khí trong ống Durham là 30 mm. Giá trị trong bảng là giá trị trung
bình của 3 lần lặp lại. Các giá trị trung bình trong cùng một cột theo sau có các mẫu tự giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở cấp độ tin cậy 95%.
Phương pháp lên men đường glucose trong ống Durham giúp đánh giá sơ bộ khả năng lên men của bốn đòng nấm men.
Trong khoảng thời gian đầu sau khi chủng giống (khoảng 3 giờ đầu) đa số các dòng nấm men tăng sinh khối vì thế khả năng lên men của các dòng nấm men tương đối chậm. Dòng P4 có khả năng tăng sinh khối cũng như lên men tương đối nhanh chỉ khoảng sau 4 giờ chiều cao cột khí CO2 đạt giá trị cao nhất (15,33 mm) so với các dòng còn lại. Sau 8 giờ lên men dòng P4 tiếp tục đạt giá trị cao nhất về chỉ tiêu chiều cao cột khí CO2, tuy nhiên tốc độ lên men chỉ tương đối. Ba dòng nấm men còn lại có chỉ tiêu cột khí CO2thấp hơn nhưng tốc độ lên men rất nhanh. So sánh về mặt thống kê thì dòng L2b2 và P4 có khả năng lên men tương đương với nhau và khác biệt không có ý nghĩa sau 8 giờ lên men. Ở thời điểm 12 giờ lên men thì dòng L2b2 và P4 tiếp tục
tuy nhiên dòng P4 tốc độ lên men chậm hơn so với dòng L2b2. Dòng L29–1 có khả năng lên men tương đối chậm hơn so với các dòng còn lai. Sau 16 giờ thì dòng L2b2 đạt chỉ tiêu chiều cao cột khí CO2 cực đại (30 mm), riêng dòng P4 khả năng lên men dừng lại (chiều cao cột khí CO2 không tăng) ở thời điểm 16 giờ. Kết quả này có thể giải thích do nấm men đã sử dụng hết đường và các chất dinh dưỡng vì vậy dòng P4 không còn khả năng lên men tiếp tục. Dòng L29–1 và L07–1 vẫn tiếp tục lên men với tốc độ tương đối chậm. Đến thời điểm 24 giờ, chiều cao cột khí CO2 của dòng L07–1 đạt cực đại trong khi dòng P4 và L29–1 không đạt chỉ tiêu này. Tuy nhiên, khi so sánh giá trị chiều cao cột khí của dòng L2b2, L07–1 và P4 cho thấy 3 dòng này có khả năng lên men tương đương với nhau và không có khác biệt về mặt thống kê với độ tin cậy 95%.
Qua kết quả thí nghiệm trên ta thấy dòng L2b2 có khả năng lên men nhanh, mạnh và ổn định nhất so với ba dòng còn lại, dòng P4 có khả năng lên men nhanh tuy nhiên chỉ ở thời gian đầu từ 4 – 12 giờ, ở thời điểm từ 16 giờ thì khả năng lên men dừng lại và chiều cao cột khí CO2 không đạt giá trị cực đại sau 24 giờ lên men. Hai dòng L29–1 và L07–1 có tốc độ lên men tương đối nhanh và ổn định.
4.4 Khả năng sinh ethanol ở nhiệt độ cao của các dòng nấm men
Khả năng sinh ethanol ở các mức nhiệt độ khác nhau của các dòng nấm men được thể hiện trong Hình 8.
Ghi chú: Số liệu trong biểu đồ là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Giá trị theo sau có các mẫu tự
giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%..
Nhìn chung ở các mức nhiệt độ tự nhiên (28 – 32°C) và 35°C các dòng nấm men sinh ethanol có nồng độ tương đương với nhau và khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Nồng độ ethanol ghi nhận đạt giá trị cao nhất ở 40°C (3,28 %w/v của dòng L2b2). Nhìn vào Hình 8 cho thấy, nồng độ ethanol có xu hướng giảm khi nhiệt độ ủ tăng lên. Cụ thể, dòng P4 và L29–1 ở mức nhiệt độ tự nhiên đến 35°C có tốc độ lên men tương đương với L2b2 và L07–1 và sản sinh ra nồng độ ethanol khác biệt không có ý nghĩa thống kê, tuy nhiên khi nhiệt độ tăng lên 40°C thì khả năng sinh ethanol giảm mạnh. Tương tự như vây, dòng L2b2 và L07–1 có khả năng lên men tương đối
Hình 8 . Ảnh hƣởng của nhiệt độ ủ lên khả năng lên men của các dòng nấm men
45°C thì khả năng sinh ethanol giảm đáng kể. Khả năng lên men của các dòng nấm men bị giảm mạnh khi nhiệt độ ủ tăng lên là do nhiêt độ quá cao đã ức chế khả năng hoạt động cũng như phát triển của nấm men. Tuy nhiên trong thí nghiệm này dòng L2b2 thể hiện khả năng lên men khá ổn định khi nhiệt độ môi trường tăng cao (40°C). Cụ thể, khi nhiệt độ ủ tăng từ tự nhiên (28 – 32°C) lên đến 40°C khả năng sinh ethanol của dòng L2b2 vẫn tương đương với nhau và không có khác biệt về mặt thống kê trong khi các dòng còn lại bị hạn chế sự phát triển khi nhiệt độ ủ tăng dần. Cụ thể như dòng L29–1 khi ủ ở mức nhiệt độ tự nhiên và 35°C thì khả năng lên men tương đương với nhau và khác biệt không có ý nghĩa thống kê, tuy nhiên khi tăng nhiệt độ ủ lên 40°C thì khả năng lên men của dòng nấm men này bị ức chế và giảm đáng kể (từ 2,93% w/v giảm xuống 1,99% w/v). Khi tăng nhiệt độ ủ lên 45°C thì khả năng lên men của L29–1 cũng như là 3 dòng nấm men còn lại dường như bị ức chế hoàn toàn. Vì vậy, trong thí nghiệm này ta dòng L2b2 thể hiện có tiềm năng hơn hẳn so với các dòng nấm men còn lại.
Vì thí nghiệm được tiến hành nhằm khảo sát khả năng lên men ở nhiệt độ cao của các dòng nấm men nên nhiệt độ ủ cho các thí nghiệm tiếp theo được chọn là 40o
C. Dòng L2b2 có khả năng chịu nhiệt và chịu ethanol tương đối cao (45°C và 15%), có khả năng lên men đường glucose tương đối nhanh và ổn định (chiều cao cột khí CO2 đạt giá trị cực đại sau 16 giờ). Thêm vào đó dòng L2b2 có khả năng sinh ethanol ở nhiệt độ cao 40°C và cho nồng độ ethanol cao nhất (3,28% w/v) so với ba dòng nấm men còn lại. Vì thế dòng L2b2 được chọn để tiến hành khảo sát các điều kiện lên men ở các thí nghiệm tiếp theo.
4.5 Các điều kiện lên men ethanol ở nhiệt độ cao của dòng nấm men đã tuyển chọn
4.5.1 Ảnh hƣởng của mật số giống chủng và nồng độ đƣờng
Khả năng sinh ethanol của dòng nấm men L2b2 với mật số giống chủng và nồng độ đường khác nhau được thể hiện trong Hình 9.
Ghi chú: Số liệu trong biểu đồ là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Giá trị theo sau có các mẫu tự
giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy là 95%.
Kết quả thí nghiệm cho thấy nghiệm thức 105 tế bào/mL – 25°Brix cho kết quả nồng độ ethanol cao nhất (là 3,03%). Nghiệm thức cho nồng độ ethanol thấp nhất là 104 tế bào/mL – 15°Brix (1,56%). Nghiệm thức 106 tế bào/mL – 25°Brix cho nồng độ ethanol tương đương so với nghiệm thức 105 tế bào/mL – 25°Brix mặc dù mật số tế bào nấm men nhiều hơn. Theo lý thuyết, cùng một lượng cơ chất, mật số nấm men ban
Hình 9 . Ảnh hƣởng của mật số giống chủng và nồng độ đƣờng lên nồng độ ethanol sinh ra
sử dụng để thực hiện quá trình trao đổi chất, phục vụ cho sự phát triển sinh khối cũng như tạo ra các sản phẩm lên men. Khi tỷ lệ nấm men càng cao thì nồng độ ethanol tạo ra càng cao, sẽ mất ít thời gian để nấm men sinh sản đủ lượng cần thiết và chất dinh dưỡng sẽ được sử dụng triệt để để tạo ethanol. Tuy nhiên từ kết quả thí nghiệm trên cho thấy nồng độ ethanol tăng chậm và giảm đáng kể khi tăng mật số giống chủng cao. Kết quả này là do tăng lượng cơ chất để kiến tạo tế bào cùng với sự cạnh tranh dinh dưỡng của nấm men xảy ra mạnh hơn vì vậy khả năng sinh ethanol giảm đàng kể. Tương tự như vây, nghiệm thức có mật số giống chủng và nồng độ đường cao nhất là 106 tế bào/ mL – 30oBrix cho nồng độ ethanol thấp (chỉ 1,9% w/v) do ảnh hưởng của mật số giống chủng đồng thời lượng đường quá cao đã vượt ngưỡng chịu đựng của nấm men dẫn đến ức chế khả năng lên men của nấm men. Từ kết quả này cho thấy trong môi trường rỉ đường khi mật số giống chủng và nồng độ đường ban đầu quá cao sẽ làm hạn chế khả năng sinh ethanol của nấm men.
Nồng độ ethanol có xu hướng thay đổi giống nhau ở tất cả các nghiệm thức: khi nồng độ đường tăng từ 15 đến 25°Brix thì nồng độ ethanol tương ứng tăng. Nhưng khi nồng độ Brix tăng lên 30°Brix thì nồng độ ethanol giảm xuống.
Đường là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men và quá trình lên men. Đường cung cấp năng lượng và nguồn carbon cho nấm men hoạt động. Khi nồng độ đường quá cao sẽ tạo ra áp suất thẩm thấu lớn gây phá hủy trạng thái sinh lý bình thường của nấm men, thời gian lên men sẽ kéo dài, sử dụng đường không triệt để, hiệu suất tạo thành rượu trên đơn vị đường giảm, lượng rượu sản sinh ra không nhiều. Ngược lại, nồng độ đường quá thấp sẽ không đủ cơ chất cho nấm men hoạt động (Nguyễn Ngọc Tú, 2002). Vì vậy, ở các nghiệm thức có nồng độ đường là 30°Brix và 15°Brix cho nồng độ ethanol không cao. Các nghiệm thức có nồng độ đường 20°Brix có nồng độ ethanol tương đối. Riêng nghiệm thức có nồng độ đường 25°Brix cho nồng độ ethanol cao nhất so với các ngiệm thức còn lại. Vì vậy nồng độ đường thích hợp nhất cho dòng L2b2 trong môi trường rỉ đường là 25o Brix.
Các nghiệm thức có mật số giống chủng là 105 tế bào/mL đa số cho nồng độ ethanol cao nhất ở các nồng độ đường khác nhau. Nồng độ ethanol đạt giá trị cao nhất ở nghiệm thức 25°Brix –105 tế bào /mL (là 3,03%). Khi mật số giống chủng thấp 104
lập cân bằng động giữa quần thể nấm men và môi trường lên men. Trong giai đoạn đầu nấm men phải tăng sinh khối lên nhiều, vì vậy nấm men phải tiêu thụ một lượng rất lớn chất dinh dưỡng cho việc hình thành tế bào mới. Vì vậy khả năng len men giảm dẫn đến lượng ethanol sinh ra ít. Còn khi mật số giống chủng cao 106
tế bào/mL nấm men sẽ sử dụng nhiều đường, cạnh tranh chất dinh dưỡng để tăng sinh khối, thiếu cơ chất để thực hiên quá trình lên men vì vậy nồng độ ethanol sinh ra thấp. Riêng ở các nghiệm thức có mật số giống chủng là 105 tế bào/mL thì đa số cho nồng độ ethanol cao nhất là do mật số nấm men đủ lớn vì vậy tỷ lệ nấm men nảy chồi thấp, chất dinh dưỡng ít bị tiêu hao cho việc xây dựng tế bào mới, quá trình lên men diễn ra hoàn toàn. Vì vậy mật số giống chủng thích hợp cho dòng L2b2 trong môi trường rỉ đường là 105
tế bào /mL.
Vì vậy mật số giống chủng và nồng độ đường được chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo là 105 tế bào /mL và 25°Brix.
Khả năng sử dụng đƣờng
Nhìn chung, lượng đường sử dụng tăng theo mật số giống chủng. Lượng đường sử dụng nhiều nhất ở nghiệm thức 105
tế bào/mL – 25°Brix. Tuy nhiên nghiệm thức này lại không cho độ rượu cao nhất chứng tỏ không phải toàn bộ lượng đường sử dụng đều được chuyển hóa thành ethanol mà nấm men còn sử dụng đường để tăng sinh khối và tạo thành các sản phẩm phụ khác. Nghiệm thức 105 tế bào/mL-25°Brix hàm lượng đương sử dụng tương đối cao và tương đương với nghiệm thức 106 tế bào/mL 25°Brix